Contando células-tronco neurais
22 de agosto de 2007
Conhecimento do número exato de células viáveis é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.
Agora vou mostrar como contar células precursoras neurais humanas. Você contaria suas células quando quisesse utilizá-las para imunoquímica ou quando quisesse realizar uma transfeção com fator nuclear máquina. Utilizo um hemocitômetro de contraste de fase que possui uma grade de borda e também usamos um corante chamado azul de trip. O corante é útil porque pode diferenciar entre células vivas e mortas.
Células mortas ou morrendo absorvem este corante e aparecem azuis. Quando você observa as células no hemocitômetro, as células vivas são capazes de excluir este corante e, portanto, não aparecem azuis. Dessa forma, é possível determinar a viabilidade das suas células para preparar uma solução de trip e azul em meio.
Vou adicionar 20 microlitros da solução de azul de pantrapa a este tubo eppendorf de 0,5 ml. Em seguida, vou adicionar 25 microlitros de meio. Dessa forma, agora tenho 45 microlitros de uma solução de azul de pantrapa e meio, de modo que, ao adicionar cinco microlitros de suspensão celular, obterei uma diluição de um para 10.
E agora vou adicionar cinco microlitros de suspensão celular. Primeiro, vou garantir que as células estejam bem ressuspendidas por meio de vortexagem com o dedo. Agora quero me assegurar de que esta solução esteja bem misturada.
Então, vou levantar e abaixar a câmara algumas vezes. E, finalmente, vou carregar cerca de 12 microlitros dessa suspensão celular em um hemocitômetro. Ele possui dois orifícios e você pode usar qualquer um deles.
Então, tudo o que você precisa fazer é introduzir a solução nesta entrada e o líquido será sugado por ação capilar. E agora estou pronto para contar. Aqui está uma visão do hemocitômetro em 10 x e aqui temos um quadrante que contém 16 quadrados.
E como você pode ver, podemos observar aqui células vivas e mortas. Aqui temos células vivas, como esta, esta e esta. E também temos algumas células mortas, como esta aqui.
Se você observar, a célula morta aparece azul-escura, enquanto as células vivas apresentam uma espécie de halo ao seu redor. Agora vou contar todas as células vivas. Vou percorrer da esquerda para a direita e de cima para baixo.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Assim, temos um total de três células seis neste quadrante. Portanto, quando vejo células que estão na borda do quadrante, como ao longo desta linha aqui, para ser consistente, conto as células que estão na borda esquerda e na borda superior.
E eu conto consistentemente as células nessas bordas para todos os quadrantes do hemocitômetro. Agora vamos calcular quantas células temos por microlitro. E, para fazer isso, vou tomar a média das células por quadrante, que é 38, e multiplicar por 10, que é um fator determinado pelas dimensões da câmara.
E também vamos multiplicar por 10, que é o nosso fator de diluição neste caso. E, no final, vamos obter o número de células por microlitro. Então, neste caso, temos 3.800 células por microlitro.
E como ressuspendemos nosso pellet celular em 500 microlitros de solução, você pode calcular quantas células no total possui. E estamos prontos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para contagem de células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) utilizando um hemocitômetro. Ele enfatiza a importância de diferenciar entre células vivas e mortas para diversas aplicações em cultura de tecidos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Cultura de Tecidos
Antecedentes
- A contagem de células viáveis é essencial para manipulações de cultura de tecidos.
- Células vivas podem excluir certos corantes, enquanto células mortas não podem.
- O hemocitômetro é uma ferramenta padrão para contagem de células.
- O corante azul de tripano é comumente usado para avaliar a viabilidade celular.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para contagem de hNSPCs.
- Diferenciar efetivamente células vivas e mortas.
- Ajudar pesquisadores no preparo para experimentos posteriores, como imunoquímica ou transfeção.
Métodos Utilizados
- Uso de um hemocitômetro com contraste de fase.
- Aplicação do corante azul de Trippan para distinguir a viabilidade celular.
- Contagem de células ao microscópio.
- Preparação de uma solução de azul de Trippan e meio de cultura.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida entre células vivas e mortas.
- Quantificação precisa de hNSPCs.
- Demonstração da eficácia do corante azul de Tripano.
- Validação do hemocitômetro como método confiável de contagem.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem simples para a contagem de células.
- É aplicável a diversos tipos celulares além dos hNSPCs.
- Compreender a viabilidade celular é essencial para experimentos bem-sucedidos de cultura de tecidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa de células-tronco/precursoras neurais humanas viáveis (hNSPCs) é essencial para fluxos de trabalho de cultura de tecidos reprodutíveis na descoberta de fármacos em neurociência. Este protocolo permite a avaliação confiável da viabilidade celular e a medição da concentração, apoiando o plaqueamento experimental consistente para aplicações posteriores, como imunocitoquímica e transfeção. Ao padronizar a discriminação entre células vivas/mortas com azul de tripano e contagem baseada em hemocitômetro, o método aumenta a confiança preditiva nos estágios iniciais de validação de alvos e nos processos de desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite o plaqueamento preciso de hNSPCs para estudos de engajamento de alvos e modulação de vias.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade em ensaios baseados em células ao garantir uma entrada consistente de células viáveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de concentração celular essenciais para a padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Apoia a preparação escalonável de suspensões celulares para formatos de triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a consistência da entrada celular nas etapas de transição de descoberta a pré-clínica.
- Valor Operacional: Facilita a colaboração entre diferentes funções por meio de práticas padronizadas de contagem celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a preparação confiável de células desde a validação do alvo até a otimização de ensaios e testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Garante a dosagem precisa de células para experimentos de validação de alvos envolvendo hNSPCs.
- Triagem: Fornece entradas padronizadas e quantificáveis de células necessárias para o desempenho reprodutível de ensaios.
- Análises: Gera concentrações viáveis de células e contagens totais utilizadas para normalizar as condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade no manuseio celular entre descobertas in vitro e modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade transferível e de baixa complexidade aplicável a múltiplos tipos celulares e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança preditiva ao minimizar a variabilidade nas entradas experimentais baseadas em células.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios e equipes.
- Valor Estratégico: Apoia decisões mais sólidas de avanço ou interrupção por meio de bases de ensaios confiáveis.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco ao garantir a qualidade dos dados na triagem inicial de eficácia.
Considerações sobre a Implementação
- Exige técnicas básicas de cultivo celular e proficiência em microscopia.
- Depende da disponibilidade de hemocitômetro e limpeza adequada para evitar contaminação.
- Necessita treinamento consistente do operador para seleção imparcial dos quadrantes e regras de contagem de bordas.
- Limitado pelo rendimento da contagem manual; não é adequado para automação de alto rendimento sem adaptação.
- Baseia-se na diluição e mistura corretas para garantir uma amostragem representativa da suspensão celular.
