Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os intermediários estruturais do DNA que ocorrem quando a replicação encontra lesões no DNA, utilizando análise em gel bidimensional. Isso é realizado primeiramente isolando o DNA de células em divisão ativa nas quais lesões que bloqueiam a replicação foram induzidas. Em seguida, a eletroforese em gel é usada para separar o DNA recuperado com base no tamanho.

Em seguida, as faixas são recortadas e recolocadas horizontalmente em um segundo gel que separa ainda mais o DNA com base no tamanho e na forma. Por fim, a análise southern é utilizada para visualizar as estruturas de DNA associadas aos fragmentos de DNA em replicação em momentos anteriores e em diversos momentos após a introdução de danos induzidos por UV. Em última análise, este procedimento pode ser usado para demonstrar que a incapacidade de processar lesões no DNA em certos mutantes resulta no acúmulo de intermediários de reparo do DNA.

Olá, meu nome é Arthur Ian. Sou do Laboratório Corella da Universidade Estadual de Portland. Olá, meu nome é Brand she, eu também sou do Laboratório Corella.

Hoje vamos mostrar um procedimento para eletroforese em gel bidimensional. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar intermediários da replicação e reparo do DNA. Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cultive uma cultura de 200 microlitros de e coli contendo o plasmídeo PBR 3 22 em meio DGC thigh com ampicilina a 37 graus Celsius. O uso do meio DGC thigh minimiza a proteção contra UV. Após a incubação noturna, pelletize as células a 14.000 RRP M por 30 segundos.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de meio DG C th sem ampicilina e inocular. 20 mililitros de meio DG C thigh para crescer culturas sem seleção por ampicilina. Em um incubador com agitação a 37 graus Celsius até uma DO 600 de 0,5, o que corresponde a cerca de cinco vezes 10 à oitava células por mililitro. O crescimento sem ampicilina evita a seleção contra intermediários de replicação anormais ou improdutivos que podem surgir em alguns mutantes.

Além disso, se utilizar luz UV para induzir danos, a remoção da ampicilina do meio é necessária porque ela absorve fortemente nesses comprimentos de onda e atua como escudo, reduzindo a dose efetiva de UV enquanto as células estão em crescimento. Utilize um fotômetro UVC para determinar a distância de uma lâmpada germicida de 15 watts que produza uma taxa de exposição de aproximadamente um JUUL por metro quadrado por segundo.

Os passos subsequentes devem ser realizados sob luz amarela, pois isso impedirá a reversão da foto-reativação dos dímeros de ciclo butano pirimidina pela fotoliase após a irradiação com UV. Assim que a densidade celular desejada for atingida, utilize uma pipeta para transferir o cultivo para uma placa de Petri de 15 centímetros de diâmetro sobre uma plataforma rotatória, a fim de garantir uma irradiação uniforme de toda a população celular. Em seguida, irradie os cultivos com 50 joules por metro quadrado e transfira-os imediatamente para um frasco estéril pré-aquecido, recolocando-os no incubador agitado a 37 graus Celsius.

Durante todo o experimento, essa dose produz em média um dímero de ciclobutano por cada 4,5 quilobases de DNA de fita simples, em cada ponto temporal a ser analisado. Pipete um alíquota de 0,75 mililitro da cultura em 0,75 mililitros de tampão NET 30 gelado. O tampão NET 30 atua como tampão de parada, impedindo a replicação e a reparação por excisão de nucleotídeos de prosseguirem.

Uma vez que o tampão de parada tenha sido adicionado, a amostra pode ser mantida em gelo até o final do curso temporal. Após o curso temporal, centrifugue cada amostra e ressuspenda os pellets. Em 150 microlitros de tampão de lise, lise as células a 37 graus Celsius por 20 minutos sem agitação.

Como estruturas replicativas com regiões de fita simples ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao cisalhamento, corte as pontas das pipetas com uma lâmina de barbear para alargar a abertura e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, a pipetagem e a agitação devem ser mantidas no mínimo até que o DNA tenha sido digerido com enzimas de restrição; após a lise, adicione proteinase K e célula sarcosina e permita que a incubação prossiga por uma hora. Isso serve para liberar fragmentos de DNA associados a proteínas.

Como o DNA em replicação ativa geralmente está ligado a complexos proteicos ou de membrana, isso ajuda a aumentar o rendimento dos fragmentos de replicação. Após uma hora, extraia as amostras adicionando dois volumes de fenol a cada amostra e invertendo suavemente os tubos por cinco minutos. Em seguida, adicione dois volumes de clorofórmio, isoamil, álcool e inverta suavemente os tubos por mais cinco minutos.

Em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 RPM em uma microcentrífuga por cinco minutos e transfira a fase aquosa superior de cada amostra para um tubo novo. Em seguida, adicione quatro volumes de álcool ISO clorofórmico e, novamente, inverta suavemente os tubos por cinco minutos. Centrifugue as amostras novamente a 14.000 RPM por cinco minutos.

Coloque uma membrana de diálise sobre 250 mililitros de 0,1 xte em um béquer e aplique 100 microlitros de cada amostra sobre a membrana. Deixe as amostras em diálise por uma hora após a diálise. Transfira 80 microlitros de cada amostra para um tubo novo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros da mistura enzimática.

Digira as amostras durante a noite a 37 graus Celsius. PV dois lineariza o plasmídeo logo após a origem de replicação. Antes de carregar o gel de agarose, adicione 100 microlitros de clorofórmio e 20 microlitros de corante de carregamento 6x contendo bromo.

Fenol azul e xileno ciano em cada amostra e misture clorofórmio irá remover qualquer PV dois ainda ligado às extremidades do DNA. Inicie a análise em gel de agarose bidimensional executando as amostras de DNA digerido através da primeira dimensão. Primeiro, carregue um marcador de tamanho Lambda hind três na primeira fileira de um gel de agarose 0,4% previamente preparado em 1x TBE.

Em seguida, carregue 40 microlitros da fase aquosa contendo o corante de carregamento para cada amostra, pulando canais para facilitar o corte do gel. Após a eletroforese, execute a primeira dimensão a um volt por centímetro durante aproximadamente 12 a 15 horas. A baixa voltagem e o gel de AGROS com baixa porcentagem servem para separar os fragmentos de DNA principalmente com base no tamanho.

Após a conclusão da primeira dimensão, utilize uma faca grande de açougueiro para recortar a primeira faixa contendo o marcador Lambda Hind III e corar com brometo de etídio. Para a segunda dimensão, corte as faixas do gel utilizando a faca grande de açougueiro, tomando como referência o marcador Lambda Hind III para o corte, e descarte a região abaixo da posição onde se espera que o plasmídeo linearizado migre em cada faixa. Para montar a segunda dimensão, posicione cada fatia horizontalmente ao longo da parte superior de um molde de gel vazio.

Prepare uma solução de 1% de AROS em um XTBE e resfrie até 55 graus Celsius. Após o resfriamento, despeje a solução do gel para moldar a segunda dimensão, certificando-se de cobrir completamente as fatias do gel. É importante garantir que as fatias estejam uniformemente orientadas e que o molde esteja nivelado antes de despejar o gel.

Uma vez que o gel tenha solidificado, realize a segunda dimensão por cinco horas e meia a sete horas a 6,5 volts por centímetro em uma unidade de eletroforese que permita a recirculação do tampão; o gel de agarose de alta voltagem e alto porcentual separa efetivamente os fragmentos de DNA com base em sua forma, bem como em seu tamanho. Formas não lineares migram mais lentamente pela segunda dimensão após a eletroforese. Enxágue o gel em água uma vez e, em seguida, lave-o duas vezes em 400 mililitros de ácido clorídrico 0,25 molar por 15 minutos com agitação suave.

As lavagens ácidas têm a função de quebrar parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores, que se transferem com maior eficiência durante a análise southern, sendo necessárias devido ao grande tamanho e à forma incomum dos intermediários da replicação do DNA. Para preparar o gel para a transferência alcalina, enxágue novamente o gel com água e, em seguida, lave-o duas vezes em 400 mililitros de hidróxido de sódio 0,4 molar por 30 minutos. O DNA nos géis é então transferido para uma membrana de nylon high bond n plus utilizando um sistema de transferência alcalina descendente com hidróxido de sódio 0,4 molar, conforme descrito na parte escrita deste procedimento. Deixe a transferência do DNA ocorrer por seis a 12 horas; após a transferência do DNA, prossiga com a hibridização da sonda conforme descrito no protocolo escrito.

Após a membrana ter sido sonda e lavada, coloque a membrana sobre uma toalha de papel até que o líquido tenha desaparecido visivelmente. Em seguida, enrole a membrana em filme plástico de cloreto de polivinila e exponha-a a uma tela de imagem de fósforo. Por fim, a radioatividade pode ser visualizada e quantificada usando um Storm 840 e seu software ImageQuant associado.

O padrão de migração do plasmídeo PBR 322 digerido por PV duas observado por análise em gel 2D de arco é esquematizado. Plasmídeos lineares não replicantes migram como um fragmento linear de 4,4 kb; plasmídeos replicantes formam estruturas em forma de Y que migram mais lentamente do que os fragmentos não replicantes devido ao seu maior tamanho e forma não linear. Esse padrão de migração forma um arco que se estende a partir da região linear em direção ao poço após irradiação por UV.

Moléculas em formato duplo Y ou X são observadas na região do cone e migram mais lentamente do que o arco de moléculas em formato Y. Um exemplo da análise southern do gel 2D sonda com PBR 322 marcado com P 32 é mostrado para células imediatamente após a irradiação com UV e 15 minutos após a irradiação com UV imediatamente após a irradiação com UV. Aproximadamente 1% do DNA plasmidial total pode ser encontrado no arco Y quando as células estão se dividindo rapidamente na fase exponencial após uma radiação.

Observa-se um aumento transitório de moléculas em forma de YS quando as forquilhas de replicação bloqueadas se acumulam em sítios danificados. Os intermediários de replicação em forma de L também se acumulam de maneira transitória e persistem até um momento que se correlaciona com o reparo das lesões. Acabamos de mostrar como visualizar intermediários de reparo do DNA utilizando eletroforese em gel bidimensional.

Ao realizar este procedimento, é importante estar atento às forças de cisalhamento que podem reduzir o rendimento e tratar com cuidado todas as amostras e géis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.