Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a toxicidade do peptídeo beta amiloide em um sistema modelo InVivo. A reprodutibilidade e a relativa simplicidade deste ensaio permitem a realização rápida de testes de fármacos, condições ambientais ou modificações genéticas sobre a toxicidade do beta amiloide. Um fator fundamental no desenvolvimento deste ensaio é a geração de vermes transgênicos de C. elegans com expressão induzível por temperatura específica de músculo do peptídeo beta amiloide.

Essa expressão sensível à temperatura é criada por meio da construção de um transgene que contém uma região não traduzida três prima anormalmente longa, tornando o RNA mensageiro do transgene um alvo do sistema de vigilância de RNA mensageiro. A expressão desse transgene é, portanto, baixa em vermes selvagens com um sistema de vigilância de RNA mensageiro funcional, devido à degradação do RNA mensageiro do transgene. Se esse transgene for introduzido em um contexto genético que contenha uma mutação em um componente essencial do sistema de vigilância de RNA mensageiro, a expressão do transgene será significativamente maior. Se o contexto genético contiver uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância de RNA mensageiro, então a propagação dessa linhagem transgênica na temperatura não permissiva bloqueará a degradação do RNA mensageiro do transgene e resultará em alta expressão do transgene. Vermines transgênicos que utilizam esse sistema para regular a expressão no músculo da parede corporal do peptídeo beta amilóide: a elevação da temperatura de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius resulta na alta acumulação do peptídeo beta amilóide, disfunção das células musculares e paralisia dos vermes. Medição do tempo.

É necessária uma população desses vermes trenchgênicos para que fiquem paralisados após a elevação da temperatura. O teste de sensibilidade à toxicidade do beta amiloide é um ensaio sensível. Isso é conseguido preparando placas frescas de meio de crescimento para nematoides para o ensaio de paralisia, o que ajuda a minimizar variáveis ambientais que possam influenciar as taxas de paralisia.

Como segundo passo, populações sincronizadas por idade de vermes transgênicos são iniciadas, o que minimiza os efeitos do estágio de desenvolvimento sobre a expressão do transgene. Em seguida, vermes sincronizados no terceiro estágio larval são transferidos de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius, aumentando a estabilidade do mRNA do transgene e levando ao acúmulo do peptídeo beta amiloide. A medição do tempo entre a transferência e a paralisia de cada verme captura a taxa de disfunção muscular, permitindo assim avaliar os efeitos tóxicos do acúmulo do peptídeo beta amiloide; os resultados obtidos demonstram o efeito de tratamentos específicos sobre a toxicidade do peptídeo beta amiloide expresso endogenamente.

Portanto, a principal vantagem da nossa técnica, em comparação com o uso de modelos de camundongos transgênicos para avaliar a atividade de fármacos, é que podemos realizá-la de forma muito mais rápida e muito menos onerosa. A demonstração visual deste método é fundamental. A pontuação de vermes L4 em um ensaio de paralisia é muito difícil de aprender.

Portanto, ao avaliar um verme paralisado L4, o que se deve observar é o movimento isolado em forma de halo na região da cabeça do verme. Quando essa região estiver em movimento e todo o corpo do verme estiver paralisado, considera-se o verme como paralisado. Os ensaios de paralisia são realizados em placas de meio de crescimento nematódio padrão, ou meio NGM, comumente utilizado para a propagação e estudos genéticos de C. elegans.

Para preparar as placas autoclavadas, autoclave a solução de NGM contendo cloreto de sódio, ágar e peptona em um frasco erlenmeyer, depois adicione as quantidades apropriadas das seguintes soluções estéreis que podem ser encontradas no protocolo escrito em anexo. Aliquote 10 mililitros de NGM líquido em cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Deixe o NGM solidificar durante a noite à temperatura ambiente.

Se estiver testando os efeitos de compostos ou extratos, alíquota o extrato em cada placa e use um espalhador para distribuí-lo uniformemente sobre a superfície da placa. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente. Volumes superiores a um mililitro exigirão mais tempo para secar.

Em seguida, aplique em cada placa 250 microlitros da linhagem de E. coli OP50 cultivada em meio LB durante a noite até uma densidade óptica de 0,4 a 0,6, e deixe as bactérias secarem durante a noite à temperatura ambiente. A idade da placa tem um efeito significativo na taxa de paralisia, e, por isso, placas mais antigas tendem a ressecar. As placas devem ser preparadas até uma semana antes do ensaio de paralisia.

Idealmente, você deve usar placas que tenham sido preparadas de três a quatro dias antes. As placas para coleta sincronizada de ovos utilizadas em qualquer experimento devem todas vir do mesmo lote. Alterar o tamanho da lawn e/ou a bactéria também modificará o comportamento dos vermes. Ensaios de paralisia podem ser realizados usando cepas alternativas de E. coli. Por exemplo, HT115 é usada em experimentos de RNAi. No entanto, isso pode alterar a cinética do ensaio de paralisia.

Portanto, você deve usar controles internos que sejam cepas apropriadas. A cepa CL 476 é a mais comumente utilizada para ensaiar uma paralisia induzida por beta. Essa cepa e outros modelos transgênicos estão disponíveis para pesquisadores acadêmicos por uma taxa simbólica no Centro Genético Saint Ahadi.

Para maximizar a sincronia etária da população-teste, é preferível iniciar com uma geração parental sincronizada. Uma semana antes de iniciar o ensaio de paralisia da população-teste, utilize um coletor de vermes de platina para transferir de 20 a 30 adultos gravidos para várias placas de NGM de 10 centímetros.

Espalhe com OP 50 para postura de ovos de duas horas a 16 graus Celsius, que é a temperatura permissiva para CL 4 1 76. Remova os adultos GR e permita que a prole cresça por sete dias, período em que atingirão a fase de adultos gravídicos do segundo dia. Segundo dia de gravidez.

Adultos são utilizados para preparar populações-teste sincronizadas por idade para cada condição experimental. O objetivo é gerar placas em triplicata contendo 50 a 75 vermes sincronizados por idade, utilizando um coletor de vermes de platina. Transfira 10 a 12 adultos do segundo dia para placas NGM de 60 milímetros com manchas de OP50. Deixe os vermes depositarem ovos a 16 graus Celsius por duas horas, depois remova os adultos e permita que os ovos eclosionem e cresçam a 16 graus Celsius.

Neste momento, é preferível que alguém que não irá pontuar as placas as codifique, de modo que a pontuação seja cega em relação às condições experimentais. O estágio de desenvolvimento embrionário no qual os ovos são postos, que é aproximadamente o estágio de 26 células para vermes selvagens em condições ideais, depende da idade e nutrição dos adultos. Se os adultos expostos à gravidade utilizados para a postura de ovos forem mais velhos ou estiverem privados de alimento, ovos em estágios mais avançados serão postos e a população sincrônica não será obtida, afetando assim a cinética do ensaio de paralisia.

É essencial usar culturas bacterianas monogênicas, como e coli, OP 50, porque qualquer contaminação bacteriana pode afetar gravemente este ensaio. A reprodutibilidade é maior se suas placas triplicadas tiverem um número semelhante de vermes para induzir o transgene e realizar o ensaio de paralisia. Eleve as placas para 25 graus Celsius.

48 horas após o término da postura sincronizada de ovos, os vermes devem estar no terceiro estágio larval. As placas devem ser organizadas sem empilhamento em um incubador a 25 graus Celsius para permitir que as placas atinjam essa temperatura. Ao mesmo tempo, inicie a avaliação da paralisia dos vermes de 18 a 20 horas após o aumento de temperatura ter sido iniciado.

Neste ponto, todos os vermes da população devem ter atingido o quarto estágio larval; continue a avaliação em incrementos de duas horas até que todos os vermes em cada placa estejam paralisados. Por razões desconhecidas, a paralisia não é uniforme ao longo do comprimento do corpo. A região da cabeça é a última parte do verme a deixar de se mover.

Assim, vermes que recentemente iniciaram a paralisia não conseguem se deslocar pela placa, mas podem mover suas cabeças, removendo as bactérias ao redor da região anterior e deixando um halo de bactérias eliminadas. Esses vermes inevitavelmente ficarão completamente paralisados e, portanto, os vermes com halos são caracterizados como paralisados. Alguns vermes não terão halos, mas também não apresentarão movimento espontâneo.

Esses são testados empurrando-os com o coletor de vermes. Se um verme empurrado não puder realizar a propagação completa da onda corporal após o estímulo, ele também é classificado como paralisado para uma pontuação eficiente. É mais fácil mover os vermes paralisados para um setor não marcado da placa para que não sejam reavaliados acidentalmente no próximo período de pontuação.

Isso também permite que vermes mal classificados demonstrem movimento, possibilitando uma correção na pontuação para gerar uma curva de paralisia. Em cada ponto temporal, a fração de vermes em cada placa que ainda não foram paralisados é convertida em uma porcentagem, e a porcentagem média não paralisada é representada graficamente em função do tempo a partir do momento em que a elevação de temperatura foi iniciada. A curva resultante é formalmente análoga a uma curva de sobrevida e, portanto, pode ser analisada utilizando estatísticas não paramétricas padrão de sobrevida.

O deslocamento para cima dos vermes transgênicos myo three A beta deve ser realizado até a fase média de L quatro para que a paralisia seja iniciada. O promotor Myo three é regulado durante o desenvolvimento. Uma vez que os vermes atingiram o estágio tardio de L quatro ou a fase adulta, o nível de expressão foi significativamente reduzido.

A expressão do transgene é bloqueada se os vermes forem privados de alimento, portanto é muito essencial que os vermes sejam bem alimentados durante todo o experimento. Nunca observamos um verme paralisado se recuperar sob qualquer condição. Após 12 a 16 horas de aumento de temperatura, CL 41 76 ficará paralisado, independentemente de você reduzir a temperatura para 16 graus na linhagem; a superexpressão da expressão do transgene que causa paralisia pode ocorrer em temperaturas mais baixas.

No entanto, observe que a taxa de paralisia será afetada em seu momento. A taxa de paralisia depende da linhagem transgênica específica utilizada. Construímos três linhagens de myo com A beta que apresentam uma taxa de paralisia mais rápida e mais lenta do que a CL 41 76, e, portanto, você precisará ajustar sua janela de avaliação para o ensaio de paralisia de acordo com isso.

Mostrado aqui está um gráfico de uma curva de paralisia para CL 4 1 76, tanto não tratado quanto exposto à cafeína 6,27 milimolar. Esse tratamento resulta em um atraso altamente significativo estatisticamente na paralisia de aproximadamente quatro horas, o que interpretamos como indicativo da supressão de uma toxicidade beta. Neste modelo, este experimento avaliou os efeitos de ol outro composto encontrado no café.

O gráfico é típico para tratamentos que não afetam a toxicidade beta. Observe que em ambos os experimentos, cerca de metade das populações não tratadas de CL 4 1 76 estão paralisadas após 24 horas e a paralisia é completa em 28 horas. Esses são os intervalos de tempo típicos para a paralisia do controle.

Populações CL 4 1 7 6 com desvios significativos em relação a esse tempo indicam condições ambientais alteradas ou deleção espontânea de cópias do transgene. Consulte o protocolo associado para obter informações adicionais sobre a linhagem CL 4 1 76. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente a idade das placas, o estágio da população de vermes e a capacidade de quantificar a taxa de paralisia dos vermes.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este sistema com *C. elegans* para avaliar cuidadosamente a toxicidade do beta amiloide. Você deverá ser capaz de detectar efeitos bastante sutis dessa toxicidade provocados por diversos tratamentos ambientais ou farmacológicos. As variáveis que discutimos são importantes para se atentar, pois isso permitirá que você realize o ensaio de forma altamente reprodutível e com cinética de paralisia consistente.

Isso é na verdade muito importante se você deseja comparar seus resultados obtidos em seu laboratório em diferentes momentos por diferentes pessoas, ou comparar seus resultados com os de outros pesquisadores que utilizam este sistema modelo.