De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Tradicionalmente, estudos biológicos e clínicos que exigem análise microscópica com resolução ao nível celular têm sido realizados executando múltiplos experimentos em paralelo, com amostras individuais removidas do estudo em pontos de tempo sequenciais para avaliação por microscopia de luz, enquanto a microscopia confocal, multiphoton e de segunda harmônica são todas técnicas úteis para imageamento in situ. A infraestrutura necessária é complexa e cara, envolvendo sistemas a laser com varredura e fontes de luz complexas. Aqui demonstramos como montar um sistema de microendoscopia de fibra óptica de alta resolução em um único dia, utilizando componentes comerciais por menos de 5.000 dólares americanos.

A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, campo de visão e comprimento de onda de operação. Primeiro, monta-se um quadro simples de microscópio de fluorescência em epifluorescência para acomodar uma fonte de luz, filtros ópticos, lentes, um feixe de fibras ópticas e uma câmera CCD. Em seguida, instalam-se as lentes de imagem, que formam uma imagem ampliada do feixe de fibras ópticas sobre a câmera CCD.

Uma fonte de LED é então instalada com óptica de iluminação para fornecer luz de excitação fluorescente à amostra. Finalmente, com o microendoscópio montado, a imagem em tempo real revela detalhes em nível celular de amostras marcadas com fluorescência, incluindo culturas in vitro, modelos animais in vivo e seres humanos. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como microscopia confocal ou multiphoton, é que ela é suficientemente simples e econômica, permitindo que pesquisadores de diversas áreas a implementem rapidamente e a personalizem de acordo com suas necessidades específicas.

O microendoscópio de alta resolução descrito aqui deve ser considerado uma configuração básica, com várias variações possíveis na montagem e aplicação. Ao selecionar componentes para uma aplicação específica, considere as relações inerentes envolvidas na microscopia de fluorescência entre concentração do fluoróforo, iluminação para fotobranqueamento, intensidade, sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição. Esta plataforma foi projetada para ser usada com proflavina como agente de contraste fluorescente, mas pode ser configurada para funcionar com outros corantes fluorescentes.

Pro flavina é uma coloração nuclear brilhante com comprimentos de onda de absorção e emissão máximos de 445 nanômetros e 515 nanômetros, respectivamente. O uso de outros agentes de contraste exigirá que o usuário selecione adequadamente os filtros de excitação, emissão e dicróico para montar o sistema de microendoscópio; comece conectando duas hastes de seis polegadas a duas hastes de 1,5 polegada para formar um par de hastes com 7,5 polegadas de comprimento. Parafuse as hastes em uma face da unidade de espelho dobrável e, em seguida, instale um espelho com diâmetro de uma polegada.

Em seguida, parafuse quatro hastes de 0,5 polegadas na face oposta da unidade do espelho dobrável. Deslize o cubo de enclausuramento sobre as hastes de 7,5 polegadas pelos dois orifícios inferiores passantes. Parafuse as hastes de duas polegadas na face lateral do cubo de enclausuramento.

Usando um adaptador de montagem C para SM1, fixe a câmera a uma placa de gaiola. Fixe a placa de gaiola nas hastes de gaiola de 0,5 polegada, alinhada com a face da unidade de espelho de dobra. Selecione uma lente tubular de diâmetro de uma polegada para formar uma imagem do feixe de fibras ópticas na câmera.

O comprimento focal da lente deve ser selecionado de modo que a causa do feixe de fibras ópticas seja amostrada por pelo menos dois pixels. Ao projetar a imagem na câmera, insira a lente em um tubo de lente com três polegadas de comprimento e fixe a lente com um anel de retenção. Uma chave de fenda de entalhes é útil para parafusar anéis de retenção em tubos de lente longos.

Solte o filtro de emissão dentro do tubo da lente de três polegadas, colocando-o sobre o primeiro anel de retenção, e adicione outro anel para fixar o filtro no lugar. Certifique-se de que a orientação do filtro satisfaça a convenção indicada pelo fabricante do filtro. Parafuse o tubo da lente no lado do cubo de proteção mais próximo à câmera CCD.

Esta posição também é mostrada aqui. Observe que, no diagrama, esta lente e filtro são mostrados sem o tubo de lente de três polegadas. Para maior clareza, conecte a câmera a um computador e visualize a imagem na tela.

Oriente o conjunto da gaiola em direção a um objeto distante e deslize o cubo da gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem do objeto apareça focalizada. Use uma chave de fenda para apertar os quatro parafusos localizados nos lados do cubo da gaiola. Esses parafusos prendem os trilhos quando apertados, mantendo o cubo na posição.

Isso garantirá que as lentes do tubo formem uma imagem focalizada do feixe de fibras na câmera quando combinadas com a lente objetiva corrigida para infinito. Em seguida, insira o espelho dicrótico no suporte e posicione-o a 45 graus no cubo de montagem. Parafuse a lente objetiva por meio de um adaptador de rosca RMS para SM e um tubo de lente ajustável na face do cubo de montagem oposta ao suporte da lente do tubo.

Em seguida, parafuse um conector SMA em uma placa de gaiola e monte-a nas hastes aproximadamente à distância de trabalho da lente objetiva. Adicione a placa base e a tampa final aos lados abertos do cubo de gaiola. Depois, monte um LED em uma placa de gaiola e deslize-o até a extremidade das hastes de duas polegadas.

Adicione uma lente a um tubo de lente de 0,5 polegadas de modo que, quando este tubo for parafusado ao lado do cubo de gaiola, forme uma imagem do LED que preencha a abertura traseira da lente objetiva. Além disso, adicione o filtro de excitação ao tubo de lente. Nesta etapa, um driver de LED pode ser usado para controlar a intensidade da luz de iluminação utilizando epóxi.

Conecte um conector SMA para uma fibra de 1030 mícrons ao feixe de fibras ópticas com campo de visão de 720 mícrons. Para obter detalhes sobre a conexão de fibras ópticas, consulte T Thor Labs, número de peça FN nine six. Um guia para conexão e polimento de fibras ópticas.

Parafuse o feixe de conectores SMA na tomada SMA montada na haste da gaiola. Direcione a extremidade distal do feixe em direção a uma fonte de luz ampla; luz fluorescente será suficiente. Em seguida, observe a imagem da face proximal do feixe na câmera CCD. Por fim, ajuste a posição da lente objetiva rosqueando-a para dentro ou para fora do cubo de gaiola.

Até que a imagem do feixe de fibras apareça em foco, a causa individual deve ser claramente visível. A resolução espacial do microendoscópio pode ser aumentada mediante a fixação de uma micro-lente ou conjunto de lentes na ponta distal do feixe de fibras. Essas ópticas são configuradas de modo que, em vez de colocar a ponta do feixe diretamente sobre o tecido, a ponta é projetada sobre a superfície do tecido com redução de magnificação.

Aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela condução da luz causada pelo feixe de fibras. O grau de redução da ampliação corresponde ao aumento na resolução espacial e, ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional do campo de visão. Selecione uma lente grin com a ampliação e distância de trabalho desejadas para a sua aplicação.

Certifique-se de que o diâmetro da lente corresponda ao do feixe de fibras com o qual você pretende trabalhar. Monte o feixe de fibras e a lente grin em estágios manuais separados de posicionamento de três eixos sob um microscópio de baixa potência ou estereoscópio para um alinhamento preciso.

Em seguida, coloque uma gota de adesivo óptico na lente ou na face do feixe. Usando os posicionadores manuais, aproxime os dois componentes até o contato. Exponha a interface à luz UV na dose recomendada pelo fabricante para curar o adesivo.

Para proteger a lente grin e a interface colada, utilize um pequeno comprimento de tubo capilar de alumínio para envolver a junção. Deslize o tubo sobre a junção e fixe-o no lugar com uma gota de epóxi em cada extremidade do tubo; use um tubo termorretrátil para finalizar a montagem. Antes da imagem microendoscópica, aplique o agente de contraste nas células ou no tecido a serem imageados para visualizar as células e o cultivo.

Primeiro, remova o meio de crescimento por pipetagem. Em seguida, adicione a solução de proflavina pipetando suavemente no poço. Após uma breve incubação de até um minuto, remova a solução de proflavina por pipetagem e descarte.

Lave as células adicionando e removendo solução fresca de PBS ao poço, montando a extremidade distal do feixe de fibras em um suporte fixo com estágios de posicionamento manual nos eixos X, Y e Z para garantir estabilidade. Durante a aquisição de imagens após a aplicação do corante em células ou tecido, posicione o feixe de fibras ópticas em contato leve com a amostra. Visualize a imagem do feixe de fibras ópticas na tela do computador, utilizando o software fornecido pelo fabricante da câmera ou qualquer software personalizado que você deseje desenvolver.

Ajuste o tempo de exposição e as configurações de ganho da câmera para obter uma imagem com brilho aceitável. Quando montado corretamente, o microendoscópio funcionará como um microscópio de fluorescência em epifluorescência, com a imagem transmitida por meio de um feixe coerente de fibras ópticas. Para obter resultados de imagem ideais, é necessário garantir que três condições principais sejam atendidas.

Primeiro, a face proximal do feixe de fibras deve ser projetada na câmera CCD sem desfoque, a fim de alcançar a resolução máxima do sistema. Aqui. Uma porção de um feixe de fibras é projetada com foco ruim, foco ligeiramente ajustado e bom foco. O foco ideal é encontrado ajustando-se a posição real da lente objetiva em relação à face do feixe.

Em segundo lugar, a face proximal do feixe de fibras deve ser iluminada uniformemente ao longo de todo o seu diâmetro. Como descrito anteriormente, isso é obtido configurando a óptica de iluminação para iluminação de colimação. A imagem mostrada aqui foi adquirida quando uma amostra fluorescente uniforme é iluminada nesta configuração preferida.

O resultado correspondente sob iluminação crítica é mostrado aqui. A estrutura do LED é projetada sobre a face do feixe de fibras, resultando na aparência desse padrão indesejado sobreposto à estrutura real da amostra. Em terceiro lugar, é importante garantir que ambas as faces, proximal e distal, do feixe de fibras estejam limpas e livres de arranhões e lascas.

Neste exemplo, detritos de imagem estão aderidos à face do feixe e um dano na forma de uma pequena lascagem às cinco horas é observado no perímetro da fibra. Os detritos podem ser removidos das faces do feixe mediante limpeza, da mesma forma que conectores ópticos convencionais, utilizando papel de lente e isopropanol ou ferramentas padrão de limpeza para fibras ópticas. Células 1483 foram marcadas com proflavina e o feixe de fibra exposto foi levemente posicionado sobre a amostra.

A imagem in vitro é mostrada aqui quando uma lente grin de 2,5 x foi ligada à ponta do feixe, obtendo-se uma melhoria na resolução espacial e uma redução no campo de visão. Realizou-se a imagem in vivo, na qual um feixe de fibras com diâmetro externo de 0,5 milímetro foi passado através de uma agulha de calibre 21 e avançado até o tecido do tecido adiposo mamário de um camundongo, conforme visto neste filme, em que adipócitos são claramente visíveis com movimento devido ao ciclo cardíaco. Neste exemplo, realizou-se a imagem da mucosa oral em um voluntário humano saudável utilizando um feixe de fibras maior, com diâmetro externo de 1,5 milímetro.

Em todos os exemplos, a pro flavina foi utilizada como agente de contraste fluorescente para marcação nuclear. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e montar um microendoscópio de fibra óptica para imageamento de fluorescência em C dois de células e tecidos.