Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Este vídeo demonstra como construir um microscópio confocal de varredura em taxa de vídeo utilizando componentes padrão disponíveis no mercado. Um microscópio confocal de varredura depende do movimento coordenado de dois espelhos de varredura para deslocar o feixe ao longo do plano raster; a luz proveniente do primeiro espelho é varrida horizontalmente através do primeiro conjunto de lentes de retransmissão, que a focaliza novamente em um ponto fixo sobre o segundo espelho de varredura. Esse mesmo movimento de varredura é então transferido através das lentes de varredura e tubo, posicionando o feixe de luz agora ampliado na abertura traseira da lente objetiva.

O segundo espelho, cujo movimento é lento em comparação com o primeiro espelho, escaneia simultaneamente o eixo Y, permitindo a ação de varredura acima e abaixo do plano ilustrado e criando um raster retangular na superfície da amostra. A principal vantagem deste protocolo em relação à compra de um microscópio comercialmente disponível é o baixo custo e a possibilidade de personalizar o instrumento de acordo com as necessidades específicas de um projeto de imagem. Ao trabalhar com qualquer laser, é essencial adotar medidas de segurança apropriadas para prevenir lesões oculares.

Certifique-se de usar óculos de segurança apropriados para laser sempre que possível. Espectadores e/ou pesquisadores que não estejam ativamente alinhando ou trabalhando com o feixe devem sempre usar óculos. Remova todos os relógios e joias brilhantes ou reflexivos.

Acima de tudo, certifique-se de seguir e controlar o feixe em todos os momentos, interrompendo seu trajeto com um bloqueador de feixe ou um cartão de visita montado. Isso é especialmente importante ao alinhar espelhos, pois o trajeto do feixe pode ser difícil de prever. Além disso, nunca posicione seus olhos ao nível do trajeto do feixe.

Desligue o laser se precisar atravessar o plano do feixe antes de montar o microscópio. Certifique-se de que todo o equipamento necessário para a montagem está disponível, incluindo a mesa óptica e os suportes em ângulo reto, todos os espelhos, lentes e o dicróico, juntamente com os grampos e os acessórios de fixação apropriados, ambos os espelhos de varredura e o detector fotônico. Também é útil ter um gerador de funções à mão para testar a ação de varredura e manipular os espelhos durante o alinhamento.

Recomenda-se também fixar a placa de montagem com parafusos para garantir estabilidade. Inicie a construção do microscópio colocando a fibra com pigtail no suporte óptico e posicionando este conjunto no centro da placa óptica. Isso corresponde à origem do feixe azul conforme mostrado aqui.

Ligue a fonte de luz. Use os parafusos de ajuste para ajustar aproximadamente o feixe, de modo que ele viaje em linha reta tanto na direção horizontal quanto na vertical. Coloque uma íris diante do colimador de fibra.

Em seguida, ajuste a altura da íris para que o feixe passe pelo centro. Depois, mova a íris para longe do ator ao longo do trajeto do feixe. Verifique o alinhamento do feixe.

Use os dois parafusos de ajuste para reposicionar o feixe na íris, se necessário. Posicione o espelho diic montado no trajeto do feixe, com o feixe a laser centralizado no espelho. Gire o suporte do espelho para refletir o feixe em aproximadamente 90 graus, garantindo que a altura do feixe não se altere.

Fixe o espelho à mesa apertando os parafusos no suporte. Em seguida, posicione o espelho galvanométrico ressonante montado no trajeto do feixe a laser. Tendo o cuidado de garantir que o feixe a laser esteja posicionado exatamente no centro horizontal da superfície do espelho.

Gire o suporte do espelho para refletir o feixe do laser em um ângulo de 90 graus. Em seguida, ajuste aproximadamente a reflexão no espelho para manter a mesma altura vertical do feixe de laser. Depois, pegue duas íris e posicione-as diretamente à frente do galvanômetro ressonante.

Em seguida, utilizando o feixe a laser refletido pelo espelho galvanométrico ressonante como referência, ajuste a altura vertical como antes. Agora, usando os furos de parafuso na mesa óptica como guia visual, fixe as duas íris em linha reta. Ajuste o primeiro espelho no trajeto, que é o dicróico, para centralizar o feixe na primeira íris.

Em seguida, ajuste o segundo espelho no trajeto. O galvanômetro ressonante deve centralizar o feixe no segundo diafragma. Ajuste iterativamente esses dois espelhos até que o feixe esteja alinhado através de ambos os diafragmas.

Certifique-se de que o feixe a laser refletido pelo espelho galvanométrico ressonante ainda seja refletido a partir do centro aproximado do espelho. Se o feixe estiver desviado, ajuste o suporte do colimador de fibra e repita os ajustes com o feixe centralizado em ambas as diafragmas abertas. O próximo passo é posicionar as duas lentes de retransmissão que irão projetar o primeiro plano telecêntrico estacionário sobre o segundo plano telecêntrico estacionário.

Para este microscópio específico, as lentes selecionadas no primeiro relé possuem o mesmo comprimento focal F, portanto a distância entre os dois espelhos aqui é simplesmente quatro F. Para esta configuração, F equivale a 90 milímetros, de modo que a posição quatro F estará a 360 milímetros de distância do espelho de varredura. Para garantir que as lentes estejam exatamente centralizadas no trajeto do feixe, coloque a primeira lente no trajeto do feixe e observe o ponto do feixe a laser na próxima diafragma no trajeto do feixe. Após a lente, ajuste a altura da lente para que o centro vertical do feixe coincida com o centro da diafragma.

Em seguida, ajuste a posição horizontal do feixe para centralizá-lo na íris. Repita este processo com a segunda lente. Em seguida, o espelho de varredura será configurado e o microscópio será rotacionado para facilitar a colocação e o alinhamento diretos das peças, que, de outra forma, precisariam ser ajustadas verticalmente.

Para encontrar a posição exata do segundo plano telecêntrico, conecte o galvanômetro ressonante O à sua unidade de varredura e ligue-o. Use um cartão de visita para acompanhar o trajeto do feixe de varredura através das duas lentes. O segundo plano telecêntrico estará localizado aproximadamente a quatro F do galvanômetro O e pode ser identificado como o ponto onde o feixe de varredura parece estacionário.

Marque a matriz de contatos abaixo desse local com um lápis. Uma vez identificado o plano telecêntrico, ajuste a entrada do espelho de varredura para zero volt e ligue o hardware de controle do espelho para que o espelho se estabilize em sua posição neutra. Em seguida, posicione o espelho galvanométrico padrão de varredura exatamente no local do plano telecêntrico.

Ajuste a posição do espelho de modo que o feixe no plano tele atinja exatamente o centro do espelho de varredura e aperte o suporte do espelho. Agora, solte o parafuso de fixação que segura o espelho galvanométrico e gire-o, garantindo que o feixe esteja se propagando verticalmente. Em seguida, desligue o laser e a eletrônica de varredura.

Desconecte a fibra e desconecte os espelhos de varredura. Em seguida, utilizando braçadeiras de montagem em ângulo reto, fixe a segunda placa à primeira.

Por fim, gire cuidadosamente todo o microscópio para que a nova placa de montagem fique plana e use o grampo para fixar o microscópio na posição. Reconecte aqui o galvanômetro e o laser e lembre-se de retornar o galvanômetro a zero volt. O restante da antiga configuração vertical pode ser facilmente montado sobre a placa plana.

A seguir, vamos montar o segundo conjunto de lentes de retransmissão, denominado formalmente lente de varredura e lente tubular. Consulte o protocolo escrito acompanhante para obter informações muito importantes sobre a escolha da combinação correta de lentes. Comece montando as lentes.

Primeiro, posicione os espelhos necessários para direcionar o feixe até a lente objetiva. Coloque o primeiro espelho grande de dois polegadas próximo à borda da mesa óptica e gire o suporte do espelho para refletir o feixe do laser aproximadamente 90 graus, de forma aproximada. Ajuste a reflexão no espelho para manter a mesma altura vertical do feixe.

Em seguida, posicione o outro espelho de dois polegadas na borda oposta da mesa óptica para direcionar o feixe em um ângulo de 90 graus e use os parafusos de ajuste para fixá-lo no lugar. Depois, monte duas íris e ajuste os dois espelhos como antes para centralizar o feixe. Em seguida, posicione a lente de varredura à distância focal do galvanômetro no trajeto do feixe e ajuste sua posição horizontal e vertical.

Para centralizar o ponto do laser na primeira íris entre os dois espelhos. Coloque cuidadosamente a lente tubular grande de duas polegadas à distância apropriada da lente de varredura e ajuste sua posição horizontal e vertical para centralizar o feixe na primeira íris. Nesta configuração, a lente tubular é colocada a uma distância de 75 milímetros mais 300 milímetros com todos os componentes no lugar.

Conecte o galvanômetro O à saída de um gerador de funções elétrico padrão ou circuito de controle e ajuste as tensões de pico a pico para um a três volts. Em seguida, inicie a varredura dos dois espelhos utilizando um cartão de visita. Localize o feixe do laser no plano estacionário, 300 milímetros após a lente tubular.

Coloque a lente objetiva no trajeto do feixe, certificando-se de posicionar a abertura traseira da lente objetiva o mais próximo possível do plano estacionário. Configure o estágio da amostra, certificando-se de que o suporte do eixo Z translacional não atinja o suporte da lente objetiva ao ser deslocado ao longo de sua faixa de movimento. Para configurar o confocal, comece desconectando todas as fontes de alimentação e as fibras ópticas do diafragma e do detector.

Gire o conjunto do microscópio para que ele repouse novamente na placa de montagem, segurando o espelho de varredura ressonante. Após reconectar a fibra ao colimador e ao espelho de varredura padrão, bem como aos cabos de alimentação, fonte e controle, aplique zero volt no controle de tensão que aciona o galvanômetro de varredura padrão, como antes na platina, e coloque uma amostra de um corante brilhante em sanduíche entre duas lamínulas. Em seguida, ligue a fonte a laser e coloque o corante em foco.

Ajuste a potência do laser para tornar a fluorescência o mais brilhante possível usando um cartão de visita. Siga a emissão fluorescente da amostra através da lente objetiva, passando pelo sistema de varredura até o espelho dicróico, que reflete o feixe de laser e transmite a emissão fluorescente. Localize esse sinal fluorescente no outro lado do espelho dicróico.

Agora, diminue a luz do ambiente. Coloque um espelho atrás do espelho dicromático para refletir a emissão em um ângulo de 90 graus. Em seguida, utilizando uma diafragma com um espelho, direcione o feixe de fluorescência o mais reto e paralelo possível à base óptica.

Em seguida, a unidade de pinhole confocal será montada utilizando o conjunto de suporte de montagem com filtro espacial da Thor Labs. Este diagrama esquematiza a montagem. O espelho de varredura situa-se em planos estacionários que são telescópicos com um objetivo estacionário.

Os pares de lentes no plano da abertura posterior entre os planos estacionários atuam para retransmitir os feixes escaneados. O primeiro par de lentes possui distâncias focais iguais, formando um telescópio um para um. O segundo par de lentes, conhecido formalmente como lente de escaneamento e lente tubular, não precisa ter distâncias focais iguais e muitas vezes atua como um telescópio ampliador de feixe, garantindo que a abertura posterior da objetiva seja superpreenchida.

A luz emitida pela amostra viaja de volta através do sistema de varredura e passa pelo espelho dicróico. Uma lente de foco curto ou uma lente objetiva focaliza a luz de emissão através do pinhole confocal, que é então colimada por uma lente. Uma lente final focaliza a emissão filtrada pelo confocal em um tubo fotomultiplicador.

Posicione a unidade de filtro espacial ao longo do trajeto do feixe de emissão, tomando cuidado para centralizar o suporte da primeira lente de foco no feixe de emissão. Neste caso, selecionou-se uma unidade de filtro espacial com um orifício de 100 micrômetros. Em seguida, monte uma lente de distância focal curta na unidade e deslize o suporte de translação em Z até que um foco nítido possa ser observado na superfície do orifício.

Certifique-se de que toda a unidade esteja orientada ao longo da linha reta definida pelo feixe fluorescente. Prenda a unidade na placa de montagem. Agora, utilizando os botões de ajuste do estágio de translação, ajuste os dois eixos para realizar uma busca bidimensional sobre a superfície do suporte do orifício de agulha, a fim de encontrar o ponto em que o sinal fluorescente através do orifício é maximizado.

Em seguida, coloque a lente de revestimento no suporte de gaiola. Após o pinhole, utilizando um cartão de visita, localize o íon fluorescente que passa pela unidade confocal e deslize a lente de revestimento ao longo dos suportes até que a fluorescência emitida esteja o mais colimada possível. Monte o conjunto do tubo fotomultiplicador. Coloque uma lente com distância focal de 50 milímetros no trajeto do feixe de emissão fluorescente e localize seu ponto focal.

Marque esta posição na placa de circuitos. Agora desligue completamente o laser e posicione o tubo fotomultiplicador de modo que sua janela fique o mais próximo possível do ponto focal marcado. Em seguida, utilizando tubos de lentes ajustáveis, conecte o conjunto à lente de focagem.

Envolva com fita escura todos os trajetos do feixe expostos após o pinhole, ligue o laser mantendo sua potência extremamente baixa. Ligue o tubo fotomultiplicador, lendo cuidadosamente sua tensão no osciloscópio. À medida que a intensidade do laser aumenta, aumente a tensão até que um sinal em forma de pico ou um deslocamento contínuo (DC offset) possa ser observado na tela do osciloscópio.

Confirme que esse sinal realmente provém da fluorescência desligando a potência do laser ou bloqueando o trajeto do feixe para observar a perda do sinal. Por fim, alinhe iterativamente o diafragma para obter o sinal máximo no osciloscópio. Primeiro manipulando a posição Z da lente de foco e depois ajustando o estágio de translação YZ, o hardware do microscópio em taxa de vídeo está completo.

Primeiro, desligue o tubo fotomultiplicador. Agora, conecte os espelhos, as placas de controle personalizadas e o computador conforme diagramado no protocolo escrito que acompanha. Este sistema pode ser adaptado para realizar microendoscopia confocal de varredura.

Ao substituir a platina por uma platina de fixação de fibra, consulte o texto ou os detalhes acompanhantes. O microscópio confocal de varredura ereto e o microendoscópio prontos devem aparecer conforme mostrado aqui. Os feixes de laser e de emissão foram desenhados como guia para os olhos.

Durante a operação de microendoscopia, um suporte para fibra mantém a fibra de imagem fixa durante os experimentos. Esse suporte para fibra pode ser facilmente substituído por uma platina XY para outras aplicações. Uma plataforma de microscópio ereto, mostrada aqui, é uma imagem representativa obtida de um M minúsculo impresso em um cartão branco, utilizando uma placa capturadora de quadros em taxa de vídeo para gerar imagens a partir do sinal recebido. Bleanchado.

O papel branco contém flúor que é facilmente excitado pela luz UV e azul, resultando em um fundo brilhante atrás da região escura. A letra M e um filtro de emissão centrado em 515 nanômetros foram escolhidos para coletar essa emissão fluorescente. Uma leve distorção da imagem pode ser observada, especialmente próximo às bordas laterais do quadro da imagem.

Essa distorção resulta do padrão de varredura senoidal do espelho gvo de oito quilohertz e é discutida em detalhes no documento anexo. Este vídeo mostra dados de taxa de vídeo de exemplo obtidos ao escanear um cartão de visita. Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como construir e alinhar um microscópio confocal de varredura de taxa de vídeo.

Não se esqueça de que trabalhar com luz laser pode ser extremamente perigoso, e precauções como remover todas as joias reflexivas, bem como evitar trabalhar com os olhos no mesmo nível do trajeto do feixe, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.