Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

A eletrofisiologia é comumente utilizada para estudar a atividade de canais iônicos dependentes de voltagem recombinantes em células de rim embrionário humano cultivadas. O registro bem-sucedido exige que as células expressem canais em níveis suficientes na membrana celular para detecção e que as células sejam semeadas em densidade celular baixa o suficiente para isolamento de células individuais. A realização de registros celulares é frequentemente prejudicada pelos longos períodos de incubação a 28 graus Celsius necessários para essa expressão, nos quais ocorre tipicamente perda de adesão celular e estabilidade da membrana.

Aqui, é demonstrado um método otimizado de cultura celular e transfeção que contorna esses problemas. As células são transfectadas em uma confluência moderada, em seguida incubadas a 28 graus Celsius até que seja alcançada uma expressão adequada de canais iônicos. As células transfectadas são então semeadas em lamínulas de vidro com baixa densidade e incubadas a 37 graus Celsius por várias horas para permitir a adesão celular e a estabilização da membrana.

Uma vez que as células apropriadas são plaqueadas, elas são então identificadas pela coexpressão de EGFP e pelo registro de patch clamp de célula inteira. O registro pode ser realizado ou as células podem ser novamente incubadas a 28 graus Celsius. Para aumentar ainda mais a expressão superficial dos canais, os resultados de experimentos de registro em células transfectadas com canais de cálcio dependentes de voltagem, como L CAV um, L CAV dois ou L cav três, indicam que os canais foram com sucesso transfectados e expressos pelas células.

Embora apenas resultados representativos para o L CAV três sejam mostrados em nosso laboratório, desenvolvemos um método para aumentar a expressão de genes de canais iônicos com baixa expressão para gravação por patch clamp em linhagens celulares humanas. Atualmente, a abordagem convencional consiste em primeiro semear as células sobre lamínulas e transfectá-las com plasmídeos contendo os genes dos canais iônicos, seguido de incubação por vários dias a 28 graus Celsius, a fim de obter alta eficiência de expressão dos canais iônicos antes da gravação eletrofisiológica. Nossa nova abordagem reduz significativamente o tempo de incubação necessário a 28 graus Celsius antes da gravação.

Agora, ao reduzir o tempo de incubação a 28 graus, constatamos que as membranas celulares são muito mais estáveis e que as células transfectadas aderem muito mais às lamínulas. Isso aumenta o número de células passíveis de gravação e torna significativamente a experimentação mais eficiente. Antes da transfeção, divida um frasco totalmente confluente de células HEK 2 9 3 T, na proporção de 1 para 4, em um novo frasco de 25 centímetros quadrados e coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Deixe as células aderirem por três a quatro horas; após quatro horas, examine as células por contraste de interferência diferencial para verificar a adesão. Observe que as células não têm mais aspecto arredondado e estão se achatando. Extensões ou pseudópodes são visíveis.

Células com menor confluência teriam a mesma aparência, mas estariam mais espaçadas. Assim que as células tiverem aderido, combine os reagentes necessários para realizar uma transfeção padrão com fosfato de cálcio. Prepare um total de 12 microgramas de DNA em 600 microlitros de solução de transfeção por frasco.

Aqui, cDNAs de diversos canais iônicos são clonados no plasmídeo P-I-R-E-S com dois EGFP. A transfeção deste vetor de expressão em uma linhagem celular de mamífero resulta na produção da proteína verde fluorescente melhorada a partir do mesmo mRNA do inserto clonado, por meio de tradução iniciada em um sítio de entrada interno de ribossomos localizado logo a jusante da sequência codificadora do canal iônico e a montante da sequência codificadora do EGFP. Isso permite identificar células transfectadas positivamente sem interferência possível na função proteica que poderia ser causada pela fusão direta da proteína EGFP à proteína de interesse.

Pipete a solução de transfeção sobre as células gota a gota, depois gire suavemente o frasco e coloque-o no incubador a 37 graus Celsius durante a noite até o dia seguinte. Verifique a eficiência de transfeção observando as células em um microscópio de fluorescência. As células positivamente transfectadas devem apresentar coloração verde em toda a extensão da célula.

Uma vez confirmada a transfeção, pipete cuidadosamente quatro a cinco mililitros de meio aquecido no frasco invertido. Lave as células virando lentamente o frasco de modo que a superfície celular fique voltada para baixo e movimente o frasco suavemente para que a solução de lavagem percorra suavemente a camada celular. Remova o meio e repita essa lavagem.

Repita o passo mais duas vezes. Em seguida, adicione seis mililitros de meio ao frasco e incube a 37 graus Celsius por duas horas. A expressão de canais iônicos de invertebrados apresenta alguns desafios.

Primeiro, eles frequentemente possuem grande tamanho e, portanto, podem levar muito tempo para serem traduzidos no retículo endoplasmático. Além disso, pode não haver um direcionamento eficiente para a membrana celular em linhagens de células de mamíferos. Por fim, como diferentes espécies apresentam frequências distintas de uso de códons, cDNAs heterólogos podem conter altas frequências de códons pouco comuns em células de mamíferos, como as células HEK 2 9 3 T, o que ajuda a superar algumas dessas dificuldades.

Após a incubação de duas horas a 37 graus Celsius, depois de lavar a transfeção, transfira os frascos para uma incubadora a 28 graus Celsius por dois a seis dias para prolongar o período de expressão. O tempo de incubação deve ser determinado empiricamente para cada tipo de canal iônico que está sendo expresso. Uma vez que a incubação a 28 graus Celsius por períodos prolongados leva à dessanexação celular e baixa estabilidade da membrana.

É necessária uma preparação adicional das células antes de realizar estudos eletrofisiológicos. Primeiro, remova o meio das células transfectadas por aspiração, pipetando um mililitro de solução de tripsina a 37 graus Celsius em um frasco invertido. Em seguida, retorne cuidadosamente o frasco à posição com a superfície celular voltada para baixo para permitir que a tripsina escorra suavemente sobre as células.

Coloque o frasco de volta e remova a tripsina. Em seguida, adicione 250 microlitros de tripsina morna diretamente sobre as células e incube a 37 graus Celsius por três a cinco minutos, até que as células se soltem. Enquanto isso, coloque de três a oito lamínulas revestidas com poli-L-lisina em uma placa de cultura de 60 milímetros e adicione cinco mililitros de meio de cultura morno.

Uma vez que as células tenham se destacado, suspenda-as em quatro mililitros de meio quente pipetando para cima e para baixo cerca de seis vezes. Em seguida, usando a ponta da micropipeta, empurre suavemente as lamínulas para garantir que estejam no fundo da placa. Então, adicione de 250 a 500 microlitros das células re-suspendidas. Incube as células a 37 graus Celsius por três horas para permitir que adiram às lamínulas.

Deixar as células por muito tempo a 37 graus resultará em divisão celular e diluição dos plasmídeos transfectados. As células transfectadas devem ser semeadas em densidade suficientemente baixa para que fiquem isoladas umas das outras, conforme mostrado aqui. Isso facilitará a gravação eletrofisiológica.

Para células que exigem subunidades acessórias, geralmente é necessário transferir as células para 28 graus Celsius e incubá-las por mais três a quatro dias antes da eletrofisiologia. O registro é realizado em células que não exigem subunidades acessórias. A gravação pode ser realizada imediatamente após essa incubação.

O equipamento de eletrofisiologia utilizado aqui inclui um amplificador, manipuladores de pipeta duplos motorizados e microscópio de fluorescência epidual, além de sistemas de perfusão. O equipamento foi montado sobre uma mesa de isolamento de vibrações e ruídos elétricos indesejados. O ruído elétrico é reduzido por uma gaiola de ferro tipo dois com 40 polegadas de altura. Os sistemas de controle eletrônico incluem um PC equipado com um digit data 1440, uma interface conversora analógico-digital em conjunto com o software P clamp 10.1.

O amplificador do monitor do computador, o manipulador motorizado e um sistema de controle de perfusão com válvula são montados fora da gaiola de Faraday. Em um rack elétrico metálico autônomo de 19 polegadas, todos os equipamentos elétricos são aterrados a um distribuidor de cobre e conectados a um transformador de isolamento de grau médico, que fornece isolamento da linha, um aterramento consistente e supressão de surtos. Prepare-se para os experimentos montando micropipetas com pontas polidas a fogo e resistência de dois a cinco megaohms no porta-micropipeta localizado no estágio de cabeça.

Os eletrodos de patch são preenchidos com solução interna, agitados levemente para remover bolhas de ar e, finalmente, montados na câmara de registro. Em seguida, com o auxílio de pinça, transfira um lamínula com células cultivadas para uma placa de Petri plástica de 35 milímetros contendo três mililitros de solução externa de registro à temperatura ambiente. O volume da solução de registro deve ser medido com precisão ao realizar experimentos com fármacos, durante os quais quantidades conhecidas do fármaco são adicionadas ao recipiente com uma micropipeta; coloque então a placa sobre a platina do microscópio.

Em seguida, encha a meia-célula do porta-eletrodo micro com cloreto de césio 3 molar. Insira o eletrodo de referência na meia-célula e coloque o eletrodo de terra no banho utilizando o micromanipulador, abaixando a pipeta de patch na solução do banho. Visualize as células no modo de fluorescência e centralize uma célula aderente verde isolada e positivamente transfectada no centro do campo de visão.

No modo banho, aproxime a pipeta de gravação até ficar próxima à célula. Zere o traçado da onda quadrada observado na tela do computador. Ajuste a posição da pipeta de gravação para que ela toque levemente a célula e o traçado da corrente quadrada na tela comece a flutuar.

Aplique sucção suave com uma seringa acoplada até que um selo de giga ohm seja formado. Após a obtenção de um selo de giga ohm, mude o programa para o modo de grampo. Aplique um pulso rápido de sucção com a seringa para romper a membrana celular.

Em seguida, mude para o modo de célula inteira e utilize os parâmetros de célula inteira no amplificador. Para compensar o transiente capacitivo, é necessário equilibrar o selamento para que a solução intracelular de gravação dialise dentro da célula selada. Insira aqui os protocolos de fixação de voltagem escritos para este experimento.

O pesquisador projetou um protocolo para medir correntes iônicas através de canais iônicos ativados por voltagem que ocorrem quando a voltagem através da membrana celular é modulada. Neste caso, estamos analisando um protocolo IV que especifica que o software mantenha a célula em menos 110 milivolts e, em seguida, faça um degrau até menos 70 milivolts por 250 milissegundos. Depois, retorne ao potencial de retenção de menos 110 milivolts, aumentando cada degrau em 10 milivolts, de modo que os passos sejam até menos 70 milivolts, menos 60 milivolts, e assim por diante, até o último passo atingir mais 20 milivolts.

Filtre as correntes registradas em 10 quilohertz utilizando um filtro Bessel de passagem baixa no amplificador e digitalize em uma frequência de amostragem de dois quilohertz usando o software Clamp X 10.1. Utilize apenas registros com vazamento mínimo inferior a 10%. Para análise, células HEK 293T foram cultivadas e transfectadas com canais de cálcio L Cav. Três canais de cálcio conforme mostrado aqui. A transfeção bem-sucedida de cDNAs heterólogos de canais iônicos foi indicada pela fluorescência gerada pelo vetor P-I-R-E-S dois eeg FP.

Aqui demonstramos a expressão bem-sucedida de um canal de cálcio voltagem-dependente cav três de invertebrado. Quando as células não são transfectadas, nenhuma corrente de cálcio pode ser elicita. Já as células transfectadas geram correntes elevadas quando protocolos de fixação de voltagem em célula inteira são aplicados às células.

Os pesquisadores podem usar diversas condições eletrofisiológicas e regimes de análise de dados conforme suas necessidades. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar seu próprio critério quanto ao momento dos experimentos. Como diferentes canais são expressos com eficiências distintas na membrana celular, cabe a você determinar a estratégia ideal para aumentar a viabilidade das células, bem como maximizar a expressão na superfície dos canais de interesse.

Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha adquirido um bom entendimento sobre como cultivar e manter uma linhagem celular humana, bem como como transfectar CDNA de canais iônicos heterólogos e CDNA de subunidades nessas células. Para gravação eletrofisiológica.