Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

Os objetivos gerais dos experimentos a seguir são compreender as propriedades das membranas excitáveis e a base iônica do potencial de repouso da membrana, além de aprender métodos para medir o potencial de membrana e demonstrar as propriedades da transmissão sináptica. Em uma parte do experimento, o potencial de repouso da membrana será medido enquanto se altera o potássio extracelular. Em outra parte do experimento, os mecanismos de diferenciação sináptica serão investigados por meio do registro de respostas sinápticas estimuladas em várias unidades motoras.

Em seguida, apresenta-se um circuito neural de fácil manutenção. Este preparo pode ser utilizado tanto para ensino quanto para investigação de diversos aspectos de um circuito sensorial para o SNC, e deste para neurônios motores e músculos. Este conjunto de experimentos demonstra a facilidade de uso do modelo de lagosta para abordar questões relacionadas à integração e transmissão sinápticas, ao potencial de membrana e às diferenças estruturais dos tipos de fibras musculares.

As principais vantagens do uso da preparação de lagostim no ensino de conceitos e técnicas eletrofisiológicos são a facilidade de dissecação, a viabilidade da preparação em salina mínima, a facilidade de obtenção de respostas sinápticas e a facilidade de discernir a organização anatômica geral dos músculos. Essas técnicas também podem ser aplicadas a outras preparações e ampliarão nosso entendimento da fisiologia e modulação sinápticas, bem como das diferenças bioquímicas e estruturais na preparação demonstrada. Para iniciar a cirurgia, selecione um lagostim com aproximadamente seis a dez centímetros de comprimento corporal e coloque-o em gelo triturado por cinco minutos para anestesiá-lo; para decapitar o lagostim, segure-o pela parte posterior da cabeça, certificando-se de manter os dedos fora do alcance das garras e da boca do animal, utilizando tesouras grandes.

Remova rapidamente a cabeça fazendo um corte limpo atrás dos olhos do lagostim, retire as pernas e garras do lagostim para evitar lesões. Remova os estilos nos machos e as nadadeiras abdominais tanto em machos quanto em fêmeas. Descarte a cabeça e os apêndices.

Em seguida, separe o abdômen do tórax fazendo um corte ao longo da membrana articuladora, que une o abdômen e o tórax. Guarde a porção abdominal do camarão-de-água-doce e descarte o tórax, orientando as tesouras ligeiramente para baixo, em direção ao lado ventral, e em um ângulo, faça um corte na carapaça ao longo da borda lateral inferior de cada lado do abdômen. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente dentro do camarão-de-água-doce.

Siga o padrão natural das linhas da carapaça do lagostim que percorrem o comprimento de cada segmento usando pinça. Remova a porção ventral da carapaça puxando-a para cima e para trás, tomando cuidado para não destruir os músculos abdominais.

Remova os músculos flexores. Neste ponto, uma massa branca de tecido pode ser vista sobre os músculos flexores profundos. Remova este tecido cuidadosamente com pinça.

O trato gastrointestinal está agora visível como um pequeno tubo que percorre a linha média dos músculos flexores profundos. Remova-o pinçando-o com uma pinça na extremidade superior e puxando-o para longe do abdômen. Corte a parte inferior do trato gastrointestinal no final da cauda.

Lave a dissecação com soro fisiológico para garantir que resíduos fecais não interfiram no preparo. Usando alfinetes de dissecação, fixe os cantos superior e inferior do preparo em uma placa de Petri revestida com S guard. Os músculos extensores abdominais agora estão expostos.

Despeje solução salina na placa de Petri para cobrir a preparação até que os registros intracelulares sejam realizados. Transfira a placa de Petri para o microscópio e use cera sob a placa para impedir que ela se mova. O equipamento utilizado para os registros intracelulares é mostrado nesta figura.

As conexões e configurações apropriadas são fornecidas no texto acompanhante. Configure o software de gravação laboratorial de acordo com as instruções. No texto acompanhante, coloque o fio terra na banho salino.

Coloque a ponta de uma micropipeta de vidro preenchida com cloreto de potássio trimolar no banho salino e teste a resistência do eletrodo. A resistência do eletrodo deve estar entre 20 e 60 megaohms. Use o botão grosso do amplificador para mover a linha no gráfico do laboratório para zero sob iluminação de alta intensidade.

Olhe pelo microscópio e identifique os músculos DEM longitudinais. Use a sonda do eletrodo para inserir o eletrodo intracelular em uma fibra muscular do músculo DEM. O eletrodo deve ser inserido apenas levemente na fibra muscular.

Tenha cuidado para não penetrar completamente através da célula. Meça a amplitude do potencial de repouso. Arraste o cursor M para o traçado a partir da localização no canto inferior esquerdo da janela do gráfico.

Coloque o marcador M na linha de base e mova o cursor até o ponto mais baixo do sinal registrado. A diferença entre o marcador e o cursor ativo é exibida no canto superior direito da tela. Esse valor corresponde à voltagem do potencial de membrana em repouso.

Divida a tensão registrada pela quantidade de amplificação; neste caso, foi utilizada uma amplificação de 10 vezes. Em seguida, converta a tensão de volts para milivolts. Após registrar o potencial de repouso dessa fibra muscular, observe pelo microscópio e remova cuidadosamente o eletrodo da fibra muscular.

Repita a gravação intracelular em outras fibras musculares. A próxima parte deste experimento monitorará o efeito do aumento da concentração extracelular de potássio sobre a membrana em repouso. Seis soluções salinas de camarão-de-água-doce serão utilizadas, com concentrações de potássio de 5,4, 20, 40, 60, 80 e 100 milimolares.

Escolha um músculo que não esteja se contraindo para realizar o próximo registro intracelular entre os registros. Substitua a solução do banho pela próxima solução de cloreto de potássio com concentração mais elevada. Certifique-se de cobrir completamente a preparação a cada vez.

Registre as alterações no potencial de membrana para cada solução. O efeito do aumento da concentração extracelular de potássio, o potencial de membrana é mostrado neste gráfico capturado na tela com os potenciais de repouso para cada concentração de potássio em um gráfico semilogarítmico da concentração extracelular de potássio versus potencial de membrana. Alinhe o potencial de repouso em 5,4 milimolar de potássio extracelular.

Para as curvas hipotéticas e observadas, compare a inclinação da linha observada com a inclinação da linha hipotética. Após concluir esses registros eletrofisiológicos, o próximo passo é examinar a anatomia das fibras musculares e seu padrão de inervação. Transfira o preparado para o recipiente de espera e adicione azul de metileno.

Após cinco minutos, remova o azul de metileno e adicione solução salina fresca para lagostim. Procure pelo nervo principal que inerva os músculos dentro de um segmento. Esboce o padrão de inervação para os músculos S-E-M-D-E-L 2D EL um e DEM em um segmento.

Em seguida, transfira o preparo para debaixo de uma capela de exaustão. Remova o soro fisiológico e adicione o fixador. O fixador utilizado aqui é uma solução poin.

O objetivo da capela de exaustão é evitar a inalação dos vapores do fixador. Tenha muito cuidado para não deixar esta solução entrar em contato com a pele ou os olhos. Se os olhos começarem a arder, lave-os imediatamente na estação de lavagem ocular.

Deixe a solução de boína permanecer na preparação por cerca de 10 minutos, e então use uma pipeta para trocar a solução por soro fisiológico. Corte um segmento fino do músculo DEL um ou DEL dois. Coloque-o sobre uma lâmina de vidro.

Rotule a lâmina. Repita o procedimento para o músculo SEM. Utilize o microscópio composto para observar o padrão de faixas do sarcômero em ambas as preparações teciduais.

A próxima série de experimentos examinará como registrar respostas sinápticas nos músculos abdominais de lagostins. Selecione outro lagostim e decapite-o. Remova o tórax e os apêndices e exponha os músculos extensores abdominais conforme mostrado na cirurgia.

Na primeira seção deste vídeo, utilizando o microscópio, localize o nervo que conduz os axônios motores até os músculos extensores. Procure o segmento com o nervo mais acessível. O nervo é branco e pode ser visto borrifando salina sobre a preparação com uma pipeta ou soprando levemente sobre a preparação.

Isso faz com que o nervo se mova e, assim, facilita a sua identificação. Posicione o eletrodo de sucção, segurado pelo micromanipulador, diretamente sobre o nervo. Puxe suavemente a seringa para atrair o nervo para dentro do eletrodo.

Pode-se observar o nervo sendo sugado para dentro do eletrodo através do microscópio. Ajuste as configurações no software do laboratório conforme especificado no artigo acompanhante. Preencha um microeletrodo de vidro com cloreto de potássio três molar e conecte-o ao estágio de cabeça e ao PowerLab.

Use o botão macro do amplificador para mover a linha no gráfico do laboratório para zero. Antes de inserir o eletrodo, o botão de alternância deve ser ligado e desligado várias vezes. Para testar a resistência do eletrodo, meça a amplitude dos valores resultantes.

Olhe pelo microscópio e use a sonda do eletrodo para inserir o eletrodo em uma das fibras musculares longitudinais, seja a DEM, a DL um ou a DL dois. Tenha cuidado para não perfurar completamente a fibra muscular. O preparo está agora pronto para o experimento.

O eletrodo de sucção é usado para estimular o feixe nervoso segmentar e o microeletrodo de vidro é usado para registrar a resposta sináptica da fibra muscular, acionando o estimulador de enxerto para estimular o nervo a um hertz para respostas fásicas. Em seguida, coloque o eletrodo em uma fibra muscular SEL. O SEL é um músculo tônico.

Estimule o nervo com rajadas curtas de pulsos a 10 hertz para obter respostas tônicas. Compare as respostas registradas dos músculos DEL e SEL. Observe que os músculos fásicos DEL apresentam respostas sinápticas de maior amplitude do que os músculos tônicos SEL.

Este próximo conjunto de experimentos foca nos músculos flexores do camarão-de-água doce, em vez dos músculos extensores. Começando com um novo camarão-de-água doce, isole o abdome conforme mostrado nesta cirurgia. Na primeira seção deste vídeo, coloque o preparado isolado da cauda em uma placa de Petri cheia de solução salina, fixando com alfinetes a cauda e a porção superior do preparado.

Observe que, nos experimentos de dec Caro sobre os músculos flexores tónicos, a cadeia ganglionar ventral deve permanecer intacta. Utilize um bisturi para iniciar um corte longitudinal através da membrana articuladora entre duas costelas na face ventral da preparação. Tenha muito cuidado para não cortar muito profundamente ao realizar este corte, pois um corte profundo poderia seccionar a raiz do nervo motor, o que garantirá que os músculos superficiais não sejam danificados.

Realize o próximo passo. Olhando através de um microscópio, use uma tesoura ou um bisturi para fazer um corte horizontal a partir do corte longitudinal na camada fina da membrana que recobre o músculo. Alargue o corte para formar uma aba da membrana articulada e levante a aba para cima.

Use uma tesoura para cortar a aba, expondo os músculos flexores superficiais para gravação intracelular a partir dos músculos flexores superficiais. Utilize a mesma instrumentação e configuração usadas anteriormente para registrar o potencial de repouso e as respostas sinápticas dos extensores abdominais. Como antes, use um eletrodo intracelular preenchido com cloreto de potássio a três molar.

Insira o eletrodo em uma fibra muscular dos músculos flexores superficiais, tomando cuidado para não atravessar o músculo. Registre a atividade espontânea dos PEPSs. Observe os diferentes tamanhos dos PEPSs e se há quaisquer PIPSs presentes.

Utilize uma pequena escova de pintura e pincele cuidadosamente ao longo da borda da cutícula dentro do mesmo segmento que contém o eletrodo de registro. Observe qualquer alteração na frequência ou no tamanho dos PEPSs devido à estimulação, caso uma resposta maior seja observada. Isso indicaria o recrutamento de neurônios motores adicionais que respondem à mudança na atividade de disparo do nervo sensorial.

Troque cuidadosamente a solução salina do banho por uma contendo um neuromodulador, como serotonina a um micromolar ou salina borbulhada com dióxido de carbono. Em seguida, repita a estimulação com o pincel. Observe o efeito que a alteração da solução do banho tem sobre a atividade registrada.

Altere a solução salina do banho de volta para a solução salina normal e observe que a atividade da fibra muscular retorna ao nível basal. Esta figura mostra PSPPs registrados em uma fibra muscular flexora superficial. Observe os diferentes tamanhos dos PSPPs.

A próxima etapa deste experimento utiliza um eletrodo extracelular para monitorar potenciais de ação de neurônios motores que respondem à atividade no circuito do nervo sensorial ao SNC e ao neurônio motor. Comece fabricando um eletrodo de sucção para estimular os nervos sensoriais. Puxe um pedaço de tubo plástico sobre uma chama.

O próximo passo é cortar o tubo até o tamanho desejado. Para isso, você precisará observar o nervo em sua preparação para estimar o diâmetro de abertura desejado para seu eletrodo de sucção. Dependendo do tamanho do camarão, os feixes nervosos podem variar de tamanho, desde cerca de um milímetro até alguns milímetros de diâmetro.

Corte a seção esticada do tubo para ajustar o tamanho da abertura na ponta, de modo que ela fique adequada para segurar o nervo. Se a abertura for muito grande, o nervo poderá se soltar. Se a abertura for muito pequena, o nervo poderá ser danificado pela pressão do eletrodo.

Coloque o tubo plástico na ponta de um eletrodo de sucção de vidro. A configuração de eletrofisiologia e software é ligeiramente diferente para o monitoramento de respostas extracelulares em comparação com a configuração para gravações intracelulares. Utilizando o equipamento especificado no artigo associado, aspire a terceira raiz nervosa que inerva o músculo flexor superficial para dentro do eletrodo de sucção.

Agora você pode começar a registrar os potenciais de ação. Esta via possui cinco neurônios motores excitatórios e um neurônio motor inibitório. Após registrar a atividade de base, estimule a cutícula com uma escova para observar a alteração nos potenciais de ação gerados.

Em seguida, substitua a solução do banho por neuromoduladores como a serotonina, conforme no experimento anterior, e registre qualquer alteração na resposta. Exercícios adicionais são fornecidos no texto complementar. Esta gravação mostra os potenciais de ação registrados da terceira via antes e durante a estimulação da cutícula com uma escova; compare a frequência dos potenciais de ação antes da escovação com sua frequência durante a estimulação.

Esta gravação mostra os potenciais de ação registrados da terceira via em solução salina normal e em uma solução de serotonina. Compare a frequência dos potenciais de ação em solução salina normal com sua frequência na serotonina, conforme mostrado anteriormente. A estimulação aumenta a frequência de disparos em relação à linha de base.

A atividade também demonstrada é que a serotonina aumenta a frequência de disparos em relação à solução salina normal. Esta figura mostra que, quando a estimulação mecânica e a serotonina são combinadas, ocorre um aumento ainda maior na frequência de disparos. A comparação entre os efeitos externos e teoricamente derivados da concentração externa de potássio sobre o potencial de membrana em repouso indica a influência dos íons no potencial de membrana.

Também mostramos como registrar respostas ntic nas junções neuromusculares de músculos fásicos e tônicos. Essas técnicas podem ser utilizadas em laboratórios investigativos para estudantes, com o objetivo de ensinar conceitos e fisiologia fundamentais. Os métodos adquiridos neste exercício laboratorial podem ser empregados para responder perguntas relacionadas a outras preparações laboratoriais, bem como aplicações fisiológicas ligadas à medicina e à saúde.