Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

O objetivo geral deste relatório é servir como uma ferramenta didática para estudantes do ensino médio avançado e de graduação em cursos de fisiologia que participam de experimentação fisiológica. Os alunos aprendem a expor e registrar contrações no intestino posterior de lagostim. Um passo adicional é a excisão do intestino posterior do animal, o que permite a aplicação direta de compostos.

Em seguida, a força e o ritmo das contrações do músculo liso do intestino posterior são monitorados enquanto se aplicam diversos agentes farmacológicos para examinar os mecanismos que alteram a intensidade da contração. São obtidos resultados que demonstram a ação de moduladores sobre a inervação neural ou diretamente sobre o músculo, com base em ensaios farmacológicos e subtipagem de receptores. Olá, sou o Dr. J. Mercier do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Brock.

Estou utilizando o intestino posterior de lagostim como preparação para realizar pesquisas sobre neurotransmissores que controlam músculos viscerais. Também tenho usado esta preparação como ferramenta didática e, como parte de uma colaboração com o laboratório da Dra. Robin Cooper na Universidade do Kentucky, estamos aperfeiçoando diversos experimentos conduzidos por alunos para fins educacionais. Este método pode proporcionar insights sobre a função do intestino posterior de lagostim.

Também pode ser aplicado em estudos de doenças, como aquelas envolvendo ritmos peristálticos. Pode ser usado ainda para descrever os mecanismos subjacentes à modulação da inervação muscular e neural. Os alunos aprenderão a interpretar dados fisiológicos e farmacológicos por meio da utilização de agentes farmacológicos, neurotransmissores e neuro-hormônios, e adquirirão uma compreensão geral da função dos receptores.

No que diz respeito a agonistas e antagonistas, os alunos construirão curvas de dose-resposta e apresentarão os dados na forma gráfica para análise estatística. Para anestesiar o animal, coloque um camarão de seis a 10 centímetros de comprimento corporal sobre gelo por cinco a 10 minutos. Segure o camarão anestesiado por trás das garras com uma das mãos. Corte rapidamente da órbita ocular até o meio da cabeça em ambos os lados e, em seguida, decapite o camarão.

O sangue da preparação será pegajoso quando for manipulado, portanto lave as ferramentas ao finalizar. Em seguida, corte as pernas e as garras. Depois, remova as nadadeiras caudais esquerda e direita, deixando a nadadeira caudal mediana, e corte ao longo do lado dorsal do abdômen até alcançar o último segmento.

Em seguida, corte ao longo do último segmento e desça pelo outro lado. Remova a carapaça dorsal. Coloque o camarão-de-água-doce dissecado na placa de Petri forrada com papel de seda.

Solução salina de baixa qualidade para lagostim. Para cobrir o preparado, utilize pinos de dissecação para fixar o preparado ao recipiente de Petri. O intestino posterior geralmente é cercado por uma massa de vasos sanguíneos e tecido conjuntivo.

Remova-os com pinça, tomando cuidado para não danificar o intestino. O intestino posterior está agora visível ao longo do abdome.

Deixe a preparação de lagostim dissecada em repouso na solução salina por cerca de 10 minutos, para que possa se recuperar do choque da dissecção e da exposição à solução salina. Observe as contrações peristálticas lentas do intestino posterior. Para iniciar, a taxa de contrações pode agora ser calculada.

Conte o número de contrações que ocorrem em 30 segundos e registre em um log. Registre também o tipo de contrações que ocorrem e se são peristálticas ou espásticas. Anote a direção de quaisquer ondas peristálticas.

Conte a frequência de contrações próximas ao ânus e no ponto médio do abdômen, verificando se há diferenças na frequência entre essas duas regiões. Tenha uma variedade de soluções de teste prontas e à mesma temperatura do salino de banho. A primeira solução testada aqui será serotonina de um micromolar preparada em salino de camarão.

Usando uma pipeta, remova o salino da cavidade do abdômen exposto do lagostim e aplique a solução de serotonina de um micromolar diretamente sobre o intestino posterior. Imediatamente após adicionar a nova solução, espere 30 segundos e, em seguida, conte as contrações ocorridas durante 30 segundos na região próxima ao ânus e, depois, conte as contrações dos próximos 30 segundos no ponto médio do abdômen. Registre esses números em um gráfico e também anote o tipo de contrações que ocorrem. Próximo.

Despeje a solução de teste do recipiente de gravação e enxágue o intestino posterior várias vezes com solução salina normal para lagostim. Em seguida, enxágue o preparo a cada 30 segundos durante cinco minutos. Neste momento, você pode adicionar a próxima solução de teste, que, nesta demonstração, é uma micromolar de Topamina.

Registre suas observações como antes e repita este processo para os demais compostos em teste. Ao usar múltiplas concentrações da mesma substância, certifique-se de começar com a concentração mais baixa e avançar para concentrações mais altas. A montagem para medir a força das contrações gastrointestinais inclui um laptop com o software LabChart 7, o Bridge Pod, o PowerLab 26T e o transdutor de força.

Antes de poder medir a força das contrações musculares do trato gastrointestinal, você precisa isolar o trato gastrointestinal. Para isso, corte os músculos no último segmento abdominal, insira dois ou mais alfinetes através da cutícula ventral mole em ambos os lados do ânus e, em seguida, remova o restante do abdômen, deixando o intestino posterior e o ânus presos a um pequeno pedaço de cutícula. O intestino deve ser cortado próximo à junção entre o tórax e o abdômen.

Agora, transfira o trato gastrointestinal para um recipiente raso com fundo revestido por sard. Há um vaso sanguíneo que percorre a face dorsal do trato gastrointestinal. Remova-o cuidadosamente do trato gastrointestinal.

Derrame salina fresca de lagostim sobre o preparo. Posicione o transdutor de força sobre o preparo. Observe atentamente o pino que está colado na parte inferior do transdutor de força.

A extremidade que se prende ao intestino possui uma pequena curvatura. Prenda a pequena curvatura do pino à extremidade cortada do intestino posterior. Após prender o intestino posterior, mova levemente o recipiente até que o intestino posterior fique esticado.

Tenha cuidado com este passo, pois o intestino deve estar tenso, mas não muito apertado. Estar muito apertado pode danificar o músculo. Quando a placa estiver na posição ideal, use cera ou argila para manter a placa firme.

Em seguida, inicie o software. Para começar a gravação, abra o software do laboratório de gráficos. Feche o laboratório de gráficos, centro de boas-vindas.

Vá até a configuração no canto superior esquerdo. Clique em configurações do canal no canto inferior esquerdo. Altere as configurações do canal para ter apenas um canal.

Clique em ok no lado direito da tela. Vá para o canal um, abra o módulo de ponte. Defina a escala na configuração mais sensível, 200 microvolts neste caso, na parte superior do gráfico no canto direito.

Defina os ciclos por segundo em 2K. Agora você está pronto para gravar. Clique em iniciar para garantir que a configuração está funcionando corretamente.

Toque levemente a ponta do transdutor com uma pipeta. Você deverá observar uma alteração na força registrada pelo software. Clique em parar no software, depois clique em iniciar e deixe o programa rodar.

Durante cerca de 20 segundos, clique em parar e adicione um comentário rotulado como salina. Calcule apenas a frequência das contrações medindo o tempo desde o início de um desvio até o início do próximo, ou contando o número total de desvios ao longo de um ou dois minutos. Calcule a frequência em contrações por minuto ou em contrações por segundo, dependendo da rapidez com que ocorrem.

Para medir a força das contrações, utilize uma medida relativa para comparar as contrações sob diferentes condições no arquivo salvo. Mova o marcador M até a linha de base, depois mova o cursor até o pico do desvio e anote o valor indicado no canto superior direito da tela. Este é um valor delta que representa a diferença entre M e o pico.

Observe que o cursor precisa ser mantido estacionário no pico para medir a alteração. Em seguida, mova o marcador M e o cursor para a próxima forma de onda de interesse e repita a medida para examinar o efeito dos moduladores. Neste preparo, troque lentamente o salino por uma solução de teste.

Neste caso, utilize um micromolar de serotonina e continue registrando a taxa e a força das contrações como último teste. Para este experimento, verifique se os inibidores de junções comunicantes alteram a taxa ou a força das contrações; os inibidores de junções comunicantes incluem etanol a 1 % ou solução salina que foi borbulhada com dióxido de carbono. Esses compostos são usados por último, pois podem danificar as fibras musculares após exposição prolongada. Para comparar o efeito dos diversos compostos, represente os dados em um gráfico.

Um outro uso interessante dessa preparação é registrar a força gerada pelos músculos circulares. No entanto, se você aplicou inibidores de junções comunicantes à sua preparação, os inibidores podem ter danificado os músculos circulares, caso em que você deve usar uma preparação fresca do intestino posterior para testar os músculos circulares. Para expor os músculos circulares, faça um corte longitudinal no tubo do intestino com uma tesoura fina.

Use pinos finos para fixar firmemente um lado ao prato. Prenda o pino com gancho do transdutor ao outro lado da tira. Exponha o preparado aos mesmos compostos testados nos músculos longitudinais; a relação entre os compostos testados e o número e tipo de contrações está mostrada aqui.

Você pode representar graficamente o número de contrações versus o tempo para as soluções de salina, serotonina e glutamato. Você pode representar graficamente o número de contrações versus a força das contrações em milivolts para as soluções de salina, serotonina e glutamato. Esses gráficos podem ser feitos tanto para os músculos longitudinais quanto para os circulares, a fim de testar se os músculos longitudinais e circulares em diferentes regiões do intestino apresentam respostas distintas aos diversos moduladores.

Os experimentos acima podem ser repetidos em diferentes regiões a partir do ânus e ao longo do abdômen. Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado para não danificar o trato gastrointestinal com a pinça e para não puxar com muita força usando o transdutor de força após este procedimento. Outros métodos, como gravações eletrofisiológicas do músculo, podem ser realizados para investigar outras questões, como funções e modulações de canais iônicos, e podem servir como modelo para outros tecidos em outros modelos animais.