Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

Olá, meu nome é Ken Paradiso. Trabalho para Ling Gang Wu no programa intramural do Instituto Nacional de Transtornos Neurológicos e Acidente Vascular, localizado no NIH no campus de Bethesda. Vou mostrar as técnicas para a gravação pré-sináptica do cálise através do método de patch clamping.

Para preparar o tecido cerebral, removemos o cérebro do rato. Colocamos o cérebro nesta solução, que deve estar gelada e com baixo teor de cálcio, e a borbulhamos com carbogênio para garantir o suprimento contínuo de oxigênio ao cérebro. Além disso, a solução precisa permanecer gelada para minimizar a DA, reduzindo ao máximo a quantidade de danos.

Então, o cérebro ficaria agora nesta solução. Retiraríamos o cérebro, cortando-o adequadamente para que possa ser colocado sobre o bloco, fixado ao bloco com Sano correlate ou cola instantânea, mas preencheríamos a câmara com uma solução fria com baixo teor de cálcio, borbulharíamos gás na solução, colocaríamos sobre o vibrátomo e então cortaríamos fatias com espessura de 180 a 190 mícrons, com uma frequência da lâmina de 70 hertz e uma velocidade de avanço de 0,01 a 0,02 milímetros por segundo. Isso corresponderia a 10 a 20 mícrons por segundo.

Após cada corte, transferimos os fragmentos do salino gelado para esta câmara, que contém solução normal de cálcio. Esta é a mesma solução na qual realizamos as gravações, mantida à temperatura fisiológica de 37 graus. Em seguida, colocamos os fragmentos aqui para recuperação.

Permanece aqui por meia hora a uma hora antes de os experimentos fisiológicos serem realizados. Então, aqui tenho o cérebro e vou retirá-lo da solução. Este é um cérebro maior, usado para fins de demonstração.

Isso é de uma rata P20. Vamos virá-la. É o tronco encefálico que nos interessa.

Então, esta área aqui embaixo e o cálice estão localizados exatamente nessa região ali. O que vamos fazer é cortar o restante do cérebro, isolar o tronco encefálico e, em seguida, preparar o tronco encefálico para a câmara de corte. Ok, então vamos fatiar o restante do cérebro, isolando apenas o tronco encefálico.

Vou virá-lo para demonstrar onde estamos. Normalmente não faríamos isso dessa maneira, e novamente, podemos simplesmente eliminar toda essa parte. Virando-o de volta, isolamos o tronco encefálico e vamos fazer mais um corte bem aqui.

Ok, é isso. É o tronco encefálico. A cápsula de Held está mais ou menos aqui e aqui.

Esta é a medula oblonga. Novamente, vamos empurrá-la um pouco para trás. Vamos cortar um dos lados do cerebelo e isso permitirá que o tronco encefálico fique de lado, assim.

Colocamos um pouco de cola acrílica Sano e, mantendo-o deitado de lado, enchemos rapidamente com gelo frio, solução fria com baixo teor de cálcio. Introduzimos a linha de oxigênio o mais rápido possível. Agora o pegamos e o levamos para o vibrátomo.

Nós avançamos rapidamente para alcançar o início do cérebro e, uma vez que chegamos ao início do cérebro, reduzimos a velocidade para 0,01 milímetros por segundo. Ou seja, 10 micros por segundo. Portanto, o movimento ocorre a uma taxa incrivelmente lenta.

A primeira porção do cérebro é a parte que possui o mtb, que é o medial Niles do corpo trapezoidal. E essa é a parte que contém, certo, então, uma vez que eu o tenho na pipeta de transferência, tento trazê-lo o mais próximo possível da ponta da pipeta. E há a fatia do cérebro, que transfiro rapidamente para esta câmara, a qual contém uma solução padrão de gravação com níveis normais de cálcio e também uma temperatura mais elevada.

E isso permitirá que as fatias se recuperem após os procedimentos de corte, ficando prontas para experimentos de fisiologia. Ok, então a partir daqui, será a mesma coisa repetidamente. O seguinte equipamento é o que usarei para realizar o patch clamping.

Temos um microscópio ereto com platina fixa. A platina é fixa, como disse, então o microscópio se move abaixo dela por meio de um manipulador. Utilizamos um manipulador microscópico Wigs e Newman para segurar a platina, a unidade principal do amplificador, e usamos um amplificador de grampo de eletrodo EPC 10 da HECA.

E o que eu também deveria ter mencionado é que utilizamos contraste de interferência diferencial (DIC) com luz infravermelha. Assim, temos uma câmera de infravermelho aqui, e tudo o que observamos será exibido na tela quando estivermos procurando por CAEs. O amplificador de patch clamp é controlado por este software, chamado Pulse, que também é da Heca, e que controlará o amplificador e todo o experimento fisiológico.

Os resultados aparecerão nesta tela. O caly mantido é um terminal pré-sináptico grande, e por ser grande, permite que façamos fisicamente um selamento no terminal. Assim, podemos realizar gravações pré-sinápticas, o que é algo único, especialmente no SNC.

Isso nos permite medir os canais de cálcio ativados de forma pré-sináptica. Além disso, também podemos medir a atividade do potencial de ação, caso desejemos estimular o nervo que leva à calota. O que fazemos neste laboratório é medir um processo chamado exocitose, que é a fusão de vesículas contendo neurotransmissores com a membrana.

Agora, quando essas vesículas se fundem com a membrana no processo chamado exocitose, elas acrescentam membrana ao terminal sináptico, e podemos medir isso como uma mudança na capacitância. Teremos um aumento na capacitância à medida que a membrana é adicionada ao terminal, de modo que os experimentos que mostrarei hoje são medições de capacitância, pré-sinápticas, realizadas quando a membrana é removida. Assim, você não pode simplesmente continuar adicionando membrana; é claro que precisa remover parte dela.

Esse processo é chamado de endocitose ou captação pela membrana. Também podemos medir isso, e será medido como uma diminuição no nível de capacitância, e mostraremos exemplos disso mais adiante. O que isso nos permite fazer é monitorar a atividade dos canais de cálcio e também acompanhar algumas das proteínas envolvidas na exocitose e na endocitose e estudá-las.

Podemos introduzir substâncias como peptídeos para bloquear proteínas envolvidas na exo ou endocitose. Também podemos usar toxinas que realizam a mesma função. Além disso, podemos ajustar as quantidades de cálcio que entram no terminal, permitindo-nos estudar de fato o processo de exocitose, a liberação do neurotransmissor, bem como a captação da membrana que ocorre após esse evento.

Este é o tubo contendo nossa solução de gravação intracelular. Preparamos essa solução com antecedência e, em seguida, a congelamos; geralmente podemos utilizá-la por várias semanas até um mês antes de precisar preparar uma nova solução. Novamente, pensamos nisso imediatamente antes de realizar nossas gravações, e você sempre acaba obtendo uma certa quantidade de partículas de poeira ou outros tipos de resíduos que entram no seu tubo.

Você pode fazer uma de duas coisas. Você pode retirar a solução e filtrá-la, ou pode centrifugá-la por um ou dois minutos e, em seguida, remover a solução, deixando uma porção inferior que conteria detritos e outros materiais. Portanto, prefiro centrifugá-la e farei isso agora mesmo.

Então, este é o tubo contendo nossa solução intracelular. Está descongelado. Vamos centrifugá-lo por cerca de dois a três minutos em uma pequena centrífuga, o que deve ser suficiente para remover quaisquer partículas grandes de poeira da solução.

Agora, retiro apenas a fração superior, a solução que acabamos de centrifugar, tomando cuidado para não agitá-la, transferindo-a para um tubo limpo, e retiro cerca de 90% dela. Procuro novamente não pegar aquela última parte pequena. Então, paro mais ou menos nesse ponto.

Coloco isso imediatamente no gelo para que permaneça bem frio durante o experimento. Isso é muito importante. Esta é, esta é uma das nossas pipetas.

Utilizamos isso para gravações intracelulares. É um vidro de sílica de parede grossa, com dois milímetros de diâmetro externo e 1,16 milímetros de diâmetro interno. Primeiro, o que fazemos é preencher a pipeta por trás.

Então aplicamos sucção, colocamos a pipeta na solução de registro e aplicamos sucção para tentar preencher a ponta muito, muito fina da pipeta, que de outra forma não se preencheria. Depois de feito isso, pegamos um tubo capilar e preenchemos o restante do eletrodo, acessando a parte traseira da sua pipeta. Esta é uma técnica padrão de fisiologia e literalmente consiste em dar um toque rápido.

Você corre o risco de quebrar a extremidade da pipeta, mas também terá, se não fizer isso, frequentemente bolhas de ar. Ok, agora colocamos na nossa porta-pipeta, que está conectada ao estágio principal do amplificador de grampo de patch. Há um fio de cloreto de prata ali.

O fio de cloreto de prata entra em contato com a solução intracelular, o que nos permite medir a atividade elétrica no terminal pré-sináptico. Assim, o que fazemos é encontrar a fatia que possui muitas CAEs. Queremos uma alta densidade de CAEs.

Então, estamos procurando o núcleo medial do corpo trapezoide, que é o MNTB, e é aí que se encontra o terminal, que forma a calota, ou seja, a calyce, como é chamada. Assim, o que fazemos é começar a varrer a fatia. Por exemplo, aqui temos uma calyce um pouco abaixo da superfície e não há muito para fazer o patch, então continuamos varrendo ao longo dela.

Então, isso é um cálice aqui que estamos visando. Fiz duas marcas na tela, que indicam onde a pipeta vai entrar. E você pode ver que há um pedaço de cálice que vou alvejar; a pipeta vai descer.

Vou aplicar pressão positiva para que ela empurre contra o cálice e, em seguida, vou aliviar a pressão positiva. O cálice então vai empurrar contra a pipeta, e nesse momento aplico uma sucção muito suave e tento sugar e empurrer a membrana ou fazer com que a membrana selada na ponta da pipeta. Tudo bem, aliviei a pressão positiva.

E agora vou aplicar sucção. Então aqui estamos com o eletrodo positivo, aplicando um pulso de cinco milivolts, ou na verdade um pulso de quatro milivolts. Ok, é isso. Ok.

Agora vamos reduzir o potencial da membrana para menos 80, cancelando o pico transitório rápido. Agora vamos para a configuração de célula inteira. Vou aplicar sucção suave e tentar romper a membrana para alcançar a configuração de célula inteira.

Esses transientes de carga indicam que ele, que a pipeta e a célula agora estão contínuas, que ele obteve uma gravação em modo integral. Esse é outro registro excelente. Assim, o vermelho mais claro era o traçado da capacitância, e você pode observar um salto súbito e, em seguida, uma diminuição.

Ok, acabei de mostrar as técnicas básicas para obter gravações de um terminal pré-sináptico do tipo calice mantido. Mostrei como produzir cortes que contêm o núcleo medial do corpo trapezoide. É ali que você encontrará os calices mantidos.

E eu mostrei a você as técnicas para analisar os cortes. Você deverá examinar cada um dos cortes, procurando aquele que apresenta o maior número de calices na superfície. Em seguida, deverá procurar a maior membrana de calice que conseguir encontrar e realizar um registro por grampo de patch nela.

E também mostrei a você as técnicas de gravação por patch clamp, e essas são técnicas padrão de gravação por patch clamp.