Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade pós-sináptica em sinapses aferentes de células ciliadas internas. Isso é realizado primeiramente expondo o epitélio sensorial de uma cóclea recentemente removida de um rato decapitado. O segundo passo do procedimento consiste em posicionar a volta apical excisada sobre uma lamínula modificada e transferi-la para a câmara de registro.

O terceiro passo do procedimento é localizar e obter acesso a um bastão aferente com um eletrodo de gravação. O passo final do procedimento é formar um selo apertado sobre a membrana da fibra aferente e, em seguida, rompê-la, estabelecendo a configuração de célula inteira da técnica de patch clamp. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ocorrência pós-sináptica ou potenciais provenientes de uma única sinapse em fita por meio da eletrofisiologia de patch clamp em configuração de célula inteira.

A demonstração visual deste método é essencial, pois o dissecção e o preparo do tecido coclear são difíceis de aprender, e as pequenas fibras aferentes são difíceis de reconhecer e acessar. Antes de iniciar a dissecção, prepare uma lamínula modificada que manterá o preparo no lugar durante as gravações. Usando uma lamínula circular de vidro com oito a 12 milímetros, aplique uma gota de Sylgard semicurado próximo à borda da lamínula.

Coloque a extremidade grossa de um alfinete fino para insetos sobre a lamínula. Segure o alfinete firmemente contra o vidro. Com pinça, aqueça a proteção da borda em uma bobina aquecida para fixá-la.

Prepare 10 a 20 microeletrodos conforme descrito no texto acompanhante. Após o polimento com chama utilizando um microforjador, o microeletrodo deve apresentar um diâmetro externo da ponta de aproximadamente um mícron. A espessura final da parede da pipeta equivale a cerca de um terço de um micrômetro após a anestesia e decapitação de um rato com três semanas de idade.

Inicie a dissecação removendo a pele ao dissecar a cabeça e retirar o cérebro. Para expor o osso temporal, remova ambos os ossos temporais. Coloque cada osso temporal em um recipiente de dissecação limpo contendo solução extracelular padrão. O próximo passo é remover o osso que envolve o osso temporal, de modo a expor a cóclea.

Segure firmemente o osso temporal na base com um par de pinças. Identifique a janela redonda e a janela oval e a cóclea. Oriente a cóclea de modo que a janela oval e o lado espiralado da cóclea fiquem voltados para cima.

Remova o excesso de osso ao redor da cóclea. Use um segundo par de pinças finas para quebrar o osso diretamente da cóclea, começando pela área que é mais transparente que o restante do osso. Nessa região, o osso é mais fino e mais fácil de remover.

Continue removendo o osso ao redor da espiral apical. Use tesoura microcirúrgica para cortar o modiolo sob a volta apical. Em seguida, desconecte a volta apical das voltas inferiores da cóclea.

Tenha cuidado para proteger a espiral apical. Ela não deve ser puxada ou esticada. Por fim, remova a volta apical da cóclea sem rasgar muito o tecido.

Use pinças finas para remover o restante do osso. O próximo passo é remover o STR dos oculis e a membrana tial. Remova cuidadosamente o STR dos oculis, a faixa brilhante de tecido situada externamente à região das células ciliadas.

Certifique-se de evitar a remoção das células ciliadas sensoriais, que podem facilmente se destacar junto com a membrana tectorial do ocelo. Em seguida, use pinças finas para destacar a membrana tectorial. A membrana semitransparente e brilhante que está localizada acima das células ciliadas sensoriais deve ter os tecidos e ossos em excesso removidos, e o preparo deve ser achatado com as pinças.

Isso é necessário para que o tecido possa ser posicionado uniformemente sob um pino. A dissecação está agora concluída. Coloque o preparado sob o pino sobre a lamínula preparada, tomando cuidado para posicionar o pino longe das células ciliadas assim que a dissecação for concluída.

Use uma pinça para transferir o preparo para a câmara de registro, mantendo uma gota de fluido extracelular sobre o lamínula que sustenta o tecido coclear, e imediatamente inicie a perfusão com solução extracelular. Para garantir melhor sobrevida do preparo, utilize a objetiva de 10 x ou a objetiva de imersão em água de 40 x com contraste de interferência diferencial (DIC) do microscópio. Para localizar o preparo, posicione-o de modo que os eletrodos de registro possam se aproximar das células ciliadas internas em ângulo reto em relação às suas paredes laterais.

Se a visibilidade da região basal das células ciliadas internas for limitada porque o preparado está encurvado, use um eletrodo de gravação para empurrar a borda externa do preparado contra a lamínula de vidro, tomando cuidado para evitar pressionar as próprias células ciliadas internas. Neste preparado, o eletrodo superior está segurando a borda externa do preparado, enquanto o eletrodo inferior marca a localização dos bastões aferentes.

Para referência, a câmera NC 70 Nuv Con exibe na tela a imagem ampliada do Forex para avaliar se o tecido na região das células ciliadas internas está saudável. Localize os feixes ciliares como ponto de referência e foque para baixo até encontrar os núcleos. Continue focando mais abaixo em direção à base das células ciliadas internas, com suas terminações aferentes, e depois volte a focar para cima até atingir o nível dos núcleos no monitor.

Agora localize os bastões aferentes ao redor da base das células ciliadas internas. Os bastões são esféricos ou elipsoidais, com aproximadamente um mícron de diâmetro, e apresentam cor clara com aparência brilhante. Você os encontrará ao focar para cima e para baixo.

O próximo passo é abrir um caminho até as fibras aferentes utilizando um eletrodo de gravação com ponta de um mícron preenchida com solução intracelular. Aplique pressão positiva e use o micromanipulador para movimentar o eletrodo até o preparado. Utilize este eletrodo para fazer uma incisão no preparado ao nível da base das células ciliadas internas.

Empurre o eletrodo entre a camada fina de células de suporte e as células ciliadas internas usando pressão positiva para abrir uma rota de acesso até a região na base das células ciliadas internas. Remova cuidadosamente o eletrodo e substitua-o por um eletrodo novo com ponta de diâmetro de um mícron preenchida com solução intracelular. Usando pressão positiva para manter a ponta do eletrodo limpa, mova o eletrodo de registro através do orifício de acesso, contornando as células de suporte adjacentes, em direção ao bastão aferente.

Certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja diretamente em frente ao batão aferente. Os batões oferecem maior resistência ao movimento da pipeta do que as células de suporte e a membrana da célula ciliar interna. Essa diferença pode ser sentida ao mover a pipeta; mova-a para cima e para baixo e empurre para verificar se o batão se move. Isso indica que a ponta da pipeta e o batão estão no mesmo plano de foco, com o eletrodo pressionado contra o batão aferente. Simultaneamente, libere a pressão positiva e aplique sucção para formar um selo de giga ohm.

Aplique suaves rajadas de sucção para romper a membrana dentro do eletrodo e obter um registro em modo de célula inteira. Se a célula selada for um bastão aferente, pequenos transientes capacitivos são observados no modo de registro de célula inteira. Esta figura mostra um transiente típico registrado de uma fibra aferente.

Inicie a gravação da atividade sináptica. Se a fibra aferente não exibir atividade espontânea, despolarize a célula ciliar aplicando uma solução extracelular com uma concentração mais elevada de potássio. Esta figura mostra as relações típicas entre corrente e voltagem para fibras AFF à esquerda e células ciliadas internas à direita.

As relações corrente-tensão foram registradas a um potencial de retenção de menos 84 milivolts, com incrementos de tensão de menos 124 milivolts a mais 36 milivolts em passos de 10 milivolts. As tensões são mostradas à direita de alguns traçados, enfocando as relações corrente-tensão de uma fibra aferente. Observe que as ocorrências excitatórias pós-sinápticas, ou EPCs, estão presentes durante a maior parte dos passos de tensão.

Os PCEs inverteram um potencial positivo em cerca de seis milivolts positivos. Esta gravação foi realizada na presença de tetrodotoxina para bloquear as correntes de sódio dependentes de voltagem; sem o bloqueador, correntes internas de sódio de ativação rápida também teriam aparecido na gravação e identificado a gravação como proveniente de uma fibra aferente. Observe a corrente interna de ativação lenta em voltagens hiperpolarizantes.

Essa corrente não está presente nas células ciliadas internas nem nas células de suporte e fornece uma boa indicação de que a gravação é proveniente de uma fibra aferente. Essas gravações mostram as relações corrente-tensão para uma célula ciliada interna. A seta aponta para as correntes de potássio para fora de ativação rápida em potenciais positivos.

Esses são seguidos por correntes de potássio retificadoras tardias devido a um diâmetro estreito da pipeta e alta resistência de acesso. As correntes das células ciliadas internas mostradas aqui são menores do que o esperado para obter gravações precisas das correntes das células ciliadas internas. Devem ser utilizadas pipetas com resistências de acesso mais baixas.

No entanto, as gravações apresentadas aqui demonstram que as relações corrente-tensão de células ciliadas internas e fibras aferentes podem ser claramente diferenciadas. Esta figura mostra correntes sinápticas registradas de uma fibra aferente. Observe o tamanho e a forma variáveis dos EPCs.

Os registros foram realizados à temperatura ambiente com tetratoína aplicada para bloquear as correntes de sódio dependentes de voltagem. Esta figura mostra registros simultâneos de uma célula ciliar interna e de um bastão aferente em contato. Um degrau de voltagem foi utilizado para despolarizar a célula ciliar interna e, em resposta, foram registradas correntes de cálcio para dentro; a entrada de cálcio na célula ciliar interna resulta na liberação de neurotransmissores e na ativação de correntes pós-sinápticas excitatórias (EPCs) no bastão aferente.

Observe que a depressão sináptica aparece durante uma despolarização de 50 milissegundos da célula ciliar interna ao realizar este procedimento. É importante lembrar-se de ter cuidado ao dissecar e preparar o tecido coclear e manter-se paciente e otimista ao tentar registrar os terminais aferentes.