A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

O objetivo geral deste procedimento é identificar clones produtores de celulase a partir de uma biblioteca metagenômica. Isso é realizado primeiramente replicando uma biblioteca metagenômica previamente construída usando um robô, seguido pela incubação da biblioteca replicada a 37 graus Celsius por 24 horas. O crescimento dos clones de E. coli é medido, e então tampão de lise e substrato são adicionados à biblioteca replicada.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram atividade de celulase por meio de medições colorimétricas de absorbância utilizando um leitor de placas. Olá, sou Keith do laboratório de Steven Hallam do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para a triagem funcional em alto rendimento de bibliotecas metagenômicas.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a atividade da celulase biomin a partir de bibliotecas metagenômicas. Então, vamos começar. Antes de iniciar este protocolo, prepare uma biblioteca metagenômica armazenada em formato de placa de 384 poços.

Este estudo utilizou o vetor SMID de controle de uma cópia do PCC em combinação com células E. coli resistentes à T um, TRANSFECT max EPI 300 T um resistentes, como hospedeiras da biblioteca para iniciar este procedimento; retire as placas contendo a biblioteca de menos 80 graus Celsius e descongele-as a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Enquanto isso, utilize a função de esterilização com luz UV no QIX dois para esterilizar o robô por 15 minutos. Configure o Q fill três conforme as instruções do fabricante, com a garrafa de meio conectada ao coletor por meio do tubo estéril programado.

O Q fill three é preenchido com a quantidade apropriada de meio e configurado para dispensar um volume de 45 microlitros. Em cada poço, elimine o ar das tubulações e do manifold utilizando a função de purgação do robô até que o meio fique visível. Em cada pino do manifold, preencha o número desejado de placas com meio LB utilizando o Q fill three.

Cada placa leva aproximadamente 20 segundos para ser preenchida. Em seguida, carregue as placas de biblioteca e as placas novas nas áreas apropriadas dos Q picks. Para preencher roboticamente as cubas de limpeza com os reagentes apropriados.

2% micro 90 no banho traseiro, água destilada em autoclave no banho central e etanol 80% no banho dianteiro. Utilizando o programa de replicação do qix two, selecione a cabeça apropriada, bem como o número e os tipos de placas de origem e de destino. Configure também a cabeça para limpeza entre as replicações.

Normalmente, seis ciclos em cada banho são suficientes. A capacidade da máquina é de 10 placas por vez. Configure a máquina para iniciar a operação.

Levará aproximadamente 15 minutos para replicá-lo. Capacidade total com uma cabeça de 384 pinos. Após a replicação das placas, incube-as a 37 graus Celsius por 24 horas em uma caixa de umidade.

O tempo prolongado de incubação é necessário porque um alto número de cópias de smid está sendo induzido com a adição de arabinose. Enquanto isso, limpe o robô Q fill three conforme descrito no protocolo escrito. Após a incubação, remova as placas do incubador a 37 graus Celsius.

Reserve as tampas e coloque as placas na plataforma de carregamento do magazine fornecida com o rapid stack. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, pois o software não o faz. As placas na parte inferior da pilha serão lidas.

Primeiro, remova um magazine do suporte rápido. Certifique-se de que ele esteja vazio e coloque-o sobre a pilha de placas a serem lidas. Segure o magazine pela alça e a placa deverá ser carregada no magazine.

Carregue a câmara na pilha rápida na orientação correta. Abra o programa de digitalização no computador conectado. Selecione uma nova sessão e atribua um nome apropriado.

Escolha uma placa de fundo plano de 384 poços como a placa. Digite na área de layout da placa. Selecione o botão do assistente e escolha adicionar 384 desconhecidos à placa.

Na área do protocolo, selecione a opção de ciclo de poços e insira para 384 poços. Um ícone de ciclo de poços aparecerá na árvore de fluxo no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar a medição fotométrica.

Configure-o para leitura em 600 nanômetros. Salve o protocolo com um nome exclusivo e feche o programa de digitalização. Em seguida, abra o programa Polara RS.

Na página principal, há uma tabela listando os instrumentos conectados ao dispositivo de empilhamento rápido sob o cabeçalho VARI scan; clique na opção iniciar sessão. Em seguida, a janela do ensaio deverá aparecer com um fluxograma no centro. Selecione o item iniciar sessão e, depois, localize o nome da varredura salva.

Selecione novamente na lista suspensa que aparece no lado direito da tela. Após selecionar o protocolo, clique em executar. Neste ensaio, uma caixa aparecerá perguntando qual revista usar como fonte e qual revista está vazia.

A caixa inferior na tela corresponde à revista frontal. Certifique-se de que tanto a pilha rápida quanto a varredura Vario estão ligadas e clique em iniciar. A pilha rápida carregará automaticamente as placas no leitor de placas, permitindo medições contínuas das placas.

Observe o carregamento da primeira placa no Vario scan para garantir o alinhamento adequado das máquinas para leitura. A leitura de 25 placas leva aproximadamente 50 minutos. Quando a leitura de Barrios for concluída, remova o magazine cheio e coloque-o na plataforma de carregamento do magazine.

Levante o retângulo externo da plataforma e o magazine deve deslizar para fora, deixando as placas em pé, empilhadas no centro. Por fim, recoloque as tampas nas placas para um teste baseado em solução. Para atividade de celulose primeiro, prepare a mistura do ensaio usando um estoque pré-feito 10 vezes concentrado de lise.

Adicione o tampão de acetato de potássio 50 milimolar, pH 5,5, conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, prepare um estoque de até 75 miligramas por mililitro do substrato corogênico DIPHENYL ou DNP biocida celular em DMSO, certificando-se de que o substrato esteja completamente dissolvido. Adicione a solução estoque de biocida celular DNP à mistura do ensaio até uma concentração final de 0,1 miligrama por mililitro.

Leve em consideração que cada placa utiliza aproximadamente 20 mililitros de solução e que um volume adicional de 50 mililitros é necessário para compensar o volume morto. Configure o Q fill three como antes, adicionando a mistura do ensaio a cada placa usando o Q fill three. Cada placa leva aproximadamente 20 segundos para ser preenchida.

Após a adição da mistura do ensaio, incubar as placas a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Em uma caixa de umidade, retirar as placas do incubador a 37 graus Celsius. Reservar as tampas e colocar as placas na plataforma de carregamento do magazine fornecida com o rapid stack, da mesma maneira que anteriormente.

Abra o programa de digitalização e configure-o como feito anteriormente, com exceção da medição fotométrica, que deve ser ajustada para leitura em 400 nanômetros. Em seguida, insira os parâmetros no programa POLARA RS, conforme demonstrado anteriormente.

Permita que o Vario scan leia as placas. Após a execução, remova e descarte as placas. Para exportar as leituras de absorbância, abra o software de digitalização e escolha.

Abra um arquivo existente. Selecione o diretório onde a sessão foi salva e clique no ícone de adição para expandir a lista. Sob o título principal, haverá opções denominadas recipiente um até recipiente N. Dependendo do número de placas, selecione a primeira placa a ser analisada na barra de menus na parte superior da página e escolha exportar relatório de dados.

Escolha as opções de exportação, como layout da placa e dados fotométricos. Clique em visualizar relatório e, em seguida, em salvar arquivo. Escolha o diretório desejado.

O formato de saída é uma planilha do Microsoft Excel. Aqui, leituras de absorbância de uma única placa de 384 poços contendo um clone positivo, conforme mostrado, indicam que clones positivos apresentam um aumento acentuado na absorbância em comparação com clones que não expressam atividade celulásica.

Diferenças no tempo do ensaio, poço, localização na placa ou concentração de DNP podem afetar as leituras absolutas de absorbância. Leituras relativas de absorbância, como a diferença na absorbância acima da média da placa ou média da coluna, são um método mais robusto para identificar clones positivos para celulase. Acabamos de mostrar como identificar clones positivos para celulase a partir de uma biblioteca metagenômica.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de dissolver seu DNP cell bio side em DMSO e de incubar suas placas em uma câmara de umidade. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.