RNA de interferência em Carrapatos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a técnica de interferência por RNA em carrapatos por meio de injeção. Isso é realizado primeiramente sintetizando RNA de fita dupla do gene ou dos genes de interesse. O RNA é então injetado nos carrapatos, que posteriormente são mantidos em uma câmara de umidade por 24 horas.

Após esse período de espera, permite-se que os carrapatos se alimentem de um animal, como uma ovelha. Parâmetros de alimentação, como peso, muda e posição dos ovos, bem como a expressão do gene ou dos genes de interesse por meio de RT-PCR em tempo real, são determinados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o efeito do silenciamento dos genes-alvo na biologia do carrapato mediante a avaliação dos parâmetros biológicos do carrapato e da expressão gênica por RT-PCR em tempo real.

Nosso grupo trabalha com carrapatos, buscando caracterizar eventos moleculares na interface carrapato-patógeno, utilizando essas informações básicas para desenvolver métodos de controle da infestação por carrapatos e da transmissão de patógenos para humanos e animais. A interferência por RNA surgiu como uma ferramenta essencial nesta pesquisa, pois é o único método disponível para manipulação genética de carrapatos. A função de muitos genes de carrapatos é desconhecida.

A interferência de RNA permite definir o papel dos genes e da expressão gênica em carrapatos em diversos aspectos da biologia desses organismos, incluindo acasalamento, reprodução, alimentação, digestão, função das glândulas salivares e competência vetorial na transmissão de patógenos. O procedimento será demonstrado pela equipe de interferência de RNA em carrapatos do nosso laboratório, o Dr. Ed Lewin, o estudante de pós-graduação Busby e eu mesmo. Para gerar RNA de fita dupla, primeiramente sintetize oligonucleotídeos iniciadores contendo sequências promotoras T7 para transcrição in vitro de RNA.

Por exemplo, lesão variável no centro dérmico. Utilize os iniciadores oligonucleotídicos D oito A a T 75 e D oito DVT 73 mostrados aqui. Amplifique o gene alvo por R-T-P-C-R usando 10 picomoles de cada iniciador oligonucleotídico e de um a 10 nanogramas de RNA total de carrapato.

Em seguida, purifique o produto da PCR. Depois, utilize oito microlitros ou aproximadamente 100 nanogramas para sintetizar RNA de fita dupla. Para preparar os carrapatos para injeção, primeiro lave os carrapatos na seguinte série de soluções: água da torneira, peróxido de hidrogênio a 3%, água destilada duas vezes, etanol a 70% e duas lavagens finais com água destilada.

Realize cada lavagem em um tubo cônico descartável de 50 mililitros agitando. Em seguida, decante a solução por meio de uma peneira de malha fina. Seque os carrapatos em papel toalha e, depois, distribua-os em alíquotas de 20 a 50, dependendo do experimento.

Coloque cada grupo em um copo plástico de 1,25 onça com tampa hermética e rotule cada copo com o grupo experimental. Em seguida, forme uma equipe de RNAi composta por três pessoas que realizarão o processo de injeção. A primeira pessoa posiciona cada carrapato em uma fita adesiva dupla fixada em uma folha de cera dental vermelha de três por seis polegadas.

A segunda pessoa injeta os carrapatos e a terceira monitora os carrapatos após a injeção, soprando dióxido de carbono sobre eles para ativá-los, e conta e transfere os carrapatos vivos para copos rotulados com o número do grupo experimental. Todos os membros da equipe devem usar luvas descartáveis. Para iniciar o processo de injeção de carrapatos, capture um carrapato usando pinça fina Dumont e coloque-o com a face ventral voltada para cima sobre fita adesiva dupla fixada na folha de cera vermelha para dentista. Posicione os carrapatos em grupos de cinco. Coloque uma pequena tira de fita crepe sobre as peças bucais dos cinco carrapatos.

Para restringi-los ainda mais, deixe a maior parte do corpo exposto para que o processo de injeção possa ser observado pelo injetor de carrapatos. Para injetar o carrapato, perfure um orifício no quadrante inferior direito da superfície ventral do exoesqueleto usando uma seringa de insulina mono eject com agulha de 29 graus e meia polegada. Em seguida, injete imediatamente nos carrapatos de 0,2 a 0,5 microlitros de solução de RNA de fita dupla usando uma seringa Hamilton personalizada e uma agulha de 33 graus com uma polegada de comprimento e ponta biselada de 45 graus, inserindo bem a agulha na cavidade do carrapato para garantir a colocação e retenção do RNA de fita dupla.

Embora o fluido seja liberado após a injeção, a colocação profunda da agulha para injeção garantirá que uma quantidade suficiente de RNA de fita dupla seja depositada na cavidade do carrapato para induzir o silenciamento gênico; deve-se ter cuidado para não exagerar. Injete os carrapatos, o que causará perda de hemolinfa e morte do carrapato. Imediatamente após a injeção, levante os carrapatos da fita adesiva dupla com pinça fina e coloque-os em um recipiente plástico de recuperação.

As carrapatos permanecerão brevemente inativos após a injeção, mas logo deverão começar a se movimentar pelo recipiente. Ative os carrapatos soprando dióxido de carbono sobre eles. Assim que os carrapatos estiverem se movendo e ativos, a ferida da injeção cicatrizará rapidamente e eles provavelmente sobreviverão.

Conte os carrapatos em cada grupo experimental e coloque cada grupo em um copo plástico rotulado com tampa bem ajustada. Substitua quaisquer carrapatos que morram no grupo atual antes de injetar o próximo grupo experimental. Limpe a seringa Hamilton antes de injetar o próximo grupo experimental preenchendo e, em seguida, expulsando a seringa com peróxido de hidrogênio a 3% fresco.

15 vezes, seguido por 15 lavagens com água estéril. Tenha cuidado para não dobrar o êmbolo da seringa Hamilton, caso contrário o êmbolo não se moverá suavemente e não responderá ao toque suave necessário para a injeção em carrapatos. Após a injeção, coloque os carrapatos em uma câmara com um recipiente contendo água e sulfato de potássio, o que mantém alta umidade e os conserva por um dia.

Em seguida, coloque carrapatos individuais em células de alimentação coladas a um carneiro e permita que se alimentem junto com um número igual de carrapatos machos ou fêmeas não injetados, conforme o sexo que não foi injetado. Colete e retire os carrapatos fêmeas da célula de alimentação após eles completarem a alimentação, por volta de 10 dias, ou quando as fêmeas controle tiverem se desprendido do hospedeiro. Incube cada grupo de carrapatos em câmara de umidade até a conclusão da postura de ovos. Avalie a postura de ovos por grupo pesando a massa de ovos produzida por todos os carrapatos de um grupo, a fim de avaliar o fenótipo dos carrapatos após a alimentação.

Determine o número de carrapatos que sobreviveram e calcule o peso dos carrapatos, bem como a posição das ovas e a fertilidade dos ovos. Dependendo do gene-alvo e dos objetivos do estudo, outras análises podem ser realizadas para confirmar o silenciamento gênico por R-T-P-C-R. Após a alimentação, dissecar as glândulas salivares e os intestinos de carrapatos individuais dos grupos injetados com controle e com RNA de fita dupla, e então extrair o RNA total das amostras individuais de tecido.

Analise os transcritos do gene-alvo em tecidos individuais por meio de R-T-P-C-R em tempo real e normalize os níveis de RNA em relação ao RNA ribossomal 16 s de carrapatos. Utilizando o método gene norm, execute curvas de dissociação ao final da reação para garantir que apenas um amplicon seja formado e que os amplicons desnaturem consistentemente na mesma faixa de temperatura para cada amostra; compare os valores de CT normalizados para os níveis de mRNA entre carrapatos injetados com controle e carrapatos injetados com RNA de dupla fita utilizando o teste T de Student.

O protocolo descrito aqui tem sido utilizado em nosso laboratório para RNAi em muitas espécies diferentes de carrapatos exóticos. A quantidade de RNA de fita dupla injetada nos carrapatos varia conforme o tamanho do carrapato. Espécies de carrapatos maiores podem acomodar um volume maior.

As referências podem ser encontradas na parte escrita acompanhante do protocolo. Se o protocolo for realizado corretamente, deve-se obter menos de 5% de mortalidade após o procedimento de injeção em 24 horas. Um fenótipo típico após a silenciamento gênico em carrapatos é mostrado aqui, onde um painel de carrapatos foi injetado com pools de RNA de fita dupla que foram utilizados para triagem de antígenos protetores em carrapatos.

Em carrapatos examinados por microscopia de luz, pode-se observar degeneração celular nos tecidos dos carrapatos. Alterações fenotípicas também podem ser acompanhadas por perda de função. Por exemplo, o RNAi de SUBIN resulta em machos estéreis que não conseguem acasalar com sucesso com as fêmeas após interferência por RNA e carrapatos.

Outros métodos podem ser utilizados para determinar o impacto do silenciamento gênico na expressão gênica e proteica e na biologia do carrapato, incluindo R-T-P-C-R em tempo real, microscopia eletrônica de luz ou confocal. Genômica ou proteômica. A interferência por RNA também pode ser realizada em culturas de células de carrapatos e fornece um método in vitro para o estudo das interações entre patógenos e células de carrapatos.