A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

O objetivo geral deste método é confinar e manipular partículas individuais em escala micro e nanométrica utilizando fluxo laminar em um dispositivo microfluídico. A armadilha hidrodinâmica consiste em um dispositivo microfluídico com geometria de canal em cruz, que gera um fluxo de ponto de estagnação na junção do microcanal. Uma válvula em chip localizada em um dos canais de saída é utilizada para controlar ativamente o fluxo de fluido e aprisionar partículas.

As partículas são confinadas em um ponto definido pelo usuário por meio do controle ativo da posição do ponto de estagnação. Um controlador de realimentação é utilizado para rastrear a posição da partícula e regular a válvula em chip para manter a posição da partícula no ponto definido. Utilizando o aprisionamento hidrodinâmico, partículas individuais são aprisionadas em soluções de partículas diluídas ou concentradas e podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência ou campo claro.

Uma única partícula pode ser confinada a até um mícron do centro da armadilha, conforme mostrado na trajetória da partícula e no histograma do deslocamento da partícula em relação ao centro da armadilha. Olá, sou Eric Johnson Rio do laboratório do Professor Charles Schroer, do Departamento de Engenharia Química e Biomolecular e do Centro de Biofísica e Biologia Computacional aqui da Universidade de Illinois. Olá, meu nome é Ari, pesquisadora pós-doutora no Laboratório Schroeder.

Olá, sou Cheryl Schroeder, e hoje vamos mostrar como fabricar e implementar um dispositivo microfluídico para o aprisionamento hidrodinâmico de partículas individuais. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como armadilhas ópticas ou eletrocinéticas, é que o aprisionamento hidrodinâmico é alcançado exclusivamente pela ação do fluxo de fluido, eliminando assim campos externos potencialmente prejudiciais para o aprisionamento de nanopartículas ou células. Esta técnica tem o potencial de transformar a ciência fundamental e aplicada, permitindo o aprisionamento em solução livre de partículas em escala micro e nanométrica, sem exigências quanto às propriedades químicas ou físicas da partícula aprisionada.

Então vamos começar. Para facilitar a remoção das réplicas dos moldes de SU-8, silanize a superfície dos moldes de SU-8 colocando as pastilhas em um dessecador sob vácuo por 10 minutos com um recipiente de vidro contendo algumas gotas de triclorosilano, utilizando PDMS misto de DGAs para as camadas fluídica e de controle. Faça a deposição por centrifugação da mistura de PDMS na proporção de 15:1 sobre o molde da camada fluídica por 30 segundos a 750 RPM e, em seguida, coloque a pastilha em uma placa de Petri.

Da mesma forma, coloque o molde da camada de controle em uma placa de Petri e despeje sobre o molde uma mistura de PDMS na proporção de cinco para um, com espessura de quatro milímetros. Para curar parcialmente as camadas de PDMS, aqueça as pastilhas ou PDMS por 30 minutos a 70 graus Celsius e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Corte a réplica de PDMS com o bisturi e desprenda-a do molde SU-8.

Em seguida, com a agulha de calibre 21, faça um orifício no PDMS como porta de acesso ao microcanal que funcionará como válvula de membrana em chip. Posicione a réplica de PDMS com a camada de controle sobre a pastilha com a camada fluidica de PDMS depositada por spin coating. Alinhe e selle cuidadosamente a camada de controle à camada fluidica utilizando um microscópio estéreo.

Certifique-se de remover todas as bolhas de ar entre as camadas e aqueça a 70 graus Celsius durante a noite para curar completamente ambas as camadas em um bloco monolítico de PDMS. Após o resfriamento à temperatura ambiente, use um bisturi para cortar e destacar o molde de PDMS do molde SU-8 e utilize uma lâmina de barbear para remover o excesso de PDMS e separar cada unidade do dispositivo. Agora, perfure orifícios de acesso aos microcanais na camada fluídica com uma agulha de calibre 21. Limpe uma lamínula com acetona e IPA e seque com nitrogênio.

Trate ambas as superfícies — a lamínula e a réplica de PDMS — com plasma de oxigênio a 500 militorr por 30 segundos. Em seguida, coloque imediatamente as duas superfícies em contato para formar um selo irreversível. Por fim, aqueça os dispositivos durante a noite para aumentar a ligação entre as camadas de PDMS e a lamínula.

Primeiro, coloque o dispositivo microfluídico sobre a platina de um microscópio invertido e fixe-o com grampos da platina. Em seguida, para introduzir as soluções no dispositivo microfluídico, encha uma seringa estanque ao gás de um mililitro e uma seringa de 250 microlitros com as soluções de tampão e de amostra, respectivamente. Utilize uma válvula em T entre a seringa da amostra e a entrada da amostra no dispositivo microfluídico para controlar a introdução da amostra.

Agora estabeleça as conexões fluidicas entre as seringas e o dispositivo microfluídico, utilizando tubos de perfluoroxi, adaptadores com trava de engate e tubos metálicos de calibre 24. Em seguida, estabeleça as conexões fluidicas para os canais de saída no dispositivo microfluídico com tubos de PFA e tubos metálicos de calibre 24. Para manter uma queda de pressão constante entre as seringas e os canais de saída, os tubos de PFA das saídas devem ter o mesmo comprimento e ambos devem estar submersos em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro cheio com solução tampão.

Encha a válvula em chip com óleo fluorado transportador usando uma seringa plástica de bloqueio tipo isca de três mililitros para evitar que o ar entre na camada fluidica durante a operação. Empurre o ar na câmara da válvula através da membrana de PDMS para dentro do microcanal. Na camada fluidica.

Para a operação da válvula em chip. Conecte uma fonte de gás inerte pressurizado à porta na camada de controle. Lave as conexões fluidicas e o dispositivo microfluídico com 0,5 mililitros de solução tampão para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas do sistema, incluindo os canais de saída.

As vazões típicas utilizadas para remoção de bolhas variam entre 2000 e 5.000 microlitros por hora após a eliminação das bolhas de ar dos canais microfluídicos; reduza então a vazão para 50 a 100 microlitros por hora, que é uma vazão volumétrica típica para aprisionamento de partículas. Agora, comute a válvula em T para permitir que a amostra flua para dentro do dispositivo microfluídico. Execute o código personalizado em LabVIEW, que automatiza o aprisionamento de partículas mediante a implementação de um algoritmo de controle com realimentação linear.

O código captura imagens de uma câmera CCD e transmite um potencial elétrico a um regulador de pressão que modula ativamente a posição de uma válvula pneumática em chip. Usando o estágio de translação XY do microscópio, posicione a região de aprisionamento no centro do campo de visão da câmera. Coloque a região de aprisionamento em foco na lente objetiva e ajuste as configurações da câmera para otimizar as condições de imagem.

Escolha uma região retangular de interesse dentro do campo de visão da câmera de forma que o centro da ROI seja a posição do centro do armadilhamento. Agora, inicialize a pressão de deslocamento aplicada à válvula em chip. Uma constrição de 100 a 200 mícrons de largura localizada no canal de saída oposto.

Fornece uma pressão de compensação para o funcionamento da válvula em chip. Inicie o controlador de realimentação e ajuste o ganho proporcional para otimizar a resposta do aprisionamento. Dependendo da taxa de fluxo e da posição da válvula em chip, existe um valor ótimo de ganho proporcional, que aumenta a estabilidade do aprisionamento e elimina oscilações indesejadas das partículas.

O código da visualização do laboratório irá automaticamente aprisionar uma das partículas que entra na região de aprisionamento. Neste vídeo, o movimento das partículas na direção do fluxo ocorre porque o canal de entrada da amostra permanece aberto, a fim de maximizar a eficiência do confinamento na direção do fluxo. O usuário pode fechar o canal da amostra durante o aprisionamento, o que equilibra uniformemente o fluxo na junção do canal em cruz, monitorar a partícula aprisionada e manter o foco da partícula dentro do plano da imagem utilizando foco manual ou um microscópio com sistema de foco automatizado.

O dispositivo microfluídico integrado consiste em um foco de amostra, uma junção em cruz e uma válvula pneumática. O aprisionamento ocorre na junção em cruz e a posição da partícula é controlada pelo ajuste ativo do campo de fluxo na junção do microcanal por meio da válvula pneumática. Aqui, uma imagem de uma única microesfera confinada na armadilha hidrodinâmica é mostrada. Além da microesfera no centro da armadilha, várias microesferas não aprisionadas são visíveis na região de aprisionamento na junção em cruz.

O trajeto de uma esfera fluorescente de poliestireno de 2,2 mícrons aprisionada é mapeado. Inicialmente, a partícula é aprisionada por três minutos. Em seguida, é liberada do aprisionamento e escapa por um dos canais de saída.

Um histograma do deslocamento de uma esfera aprisionada em relação ao centro do aprisionamento ao longo da direção dos canais de saída indica que a partícula é confinada a menos de um mícron do centro do aprisionamento. Hoje, apresentamos o aprisionamento EM como um método para aprisionamento em solução livre de partículas em escala micro e nanométrica, utilizando um ponto de estagnação gerado dentro de um dispositivo microfluídico. O aprisionamento hidrodinâmico permite o confinamento de uma única partícula-alvo em suspensões concentradas de partículas, o que é difícil de alcançar com métodos alternativos de aprisionamento baseados em campos de força.

Após desenvolvimento adicional, esta nova técnica permitirá a exploração científica nas áreas de biofísica, mecânica celular, dinâmica dos fluidos, enzimologia e biologia de sistemas. Obrigado por assistir e esperamos que esta técnica seja útil para os seus experimentos.