Captura de célula usando um dispositivo micro

Os dispositivos, conforme os preparamos, são embalados em kits de 10 ou 20, e quando chegam, são enviados frios em uma caixa, e o kit contém todos os componentes necessários para a realização do experimento. No kit, há um pacote com todas as seringas e tampões, que podem permanecer em temperatura ambiente. Há também uma cópia do protocolo que vamos seguir neste experimento.

Há também uma caixa refrigerada, que contém os dispositivos reais e todos os tampões de corrida que precisam ser refrigerados. Normalmente, os kits são embalados em grupos de 10 ou 20. Quando não estiverem em uso, os kits devem ser refrigerados.

Cada seringa e cada componente do kit é cuidadosamente rotulado, e os rótulos correspondem à tabela no protocolo que seguimos. Assim, não há ambiguidade quanto à seringa ou componente do kit que deve ser usado em cada etapa individual. Após desembalar os dispositivos e colocá-los em uma cabine de segurança biológica, realizaremos o procedimento de isolamento dos neutrófilos e sua lise para aplicações genômicas subsequentes, pois o material biológico que obtivermos será utilizado para o isolamento, ou seja, extrairemos o RNA do lisado celular.

Por isso, queremos garantir que nossa área esteja limpa, não apenas no sentido estéril, mas também livre de qualquer RNA presente normalmente no ambiente. Assim, é muito importante limpar toda a área e os equipamentos com uma solução que destrua RNAs. Normalmente, limpamos todas as nossas ferramentas e superfícies de trabalho com RNA SAP ou RNAs away, que podem ser obtidos de diversos fabricantes.

O dispositivo vem embalado em um envelope selado a calor. Cada dispositivo é lacrado e possui um código de barras neste código de barras. Você deve anotar este código de barras se estiver trabalhando com quaisquer amostras clínicas.

Portanto, o dispositivo é aberto, a tampa é removida e ele é colocado no manifold de retenção da bomba. A amostra de sangue que utilizamos é uma amostra de sangue total. Vamos fazê-la fluir através da seringa padrão de um mililitro da BD, e esta é a seringa rotulada como uma.

Normalmente, o que se faz é remover a seringa da embalagem e retirar cuidadosamente a tampa do tubo de sangue. Em seguida, adiciona-se 700 microlitros ou 0,7 mililitros de sangue e injeta-se metade dessa quantidade, ou seja, 350 microlitros, em um tubo de 1,5 mililitro. Dessa forma, seu sangue pode ser encaminhado para processamento adicional.

Seu, seu tubo de sangue pode ser repassado e ainda assim você terá mais sangue sobrando em caso de falha de um dispositivo. Então, agora o que vamos fazer é carregar a seringa que contém sangue, nessa agulha, que está conectada a um trecho de tubo com este dispositivo. Queremos ter muito cuidado, com, com o dispositivo de isolamento microfluídico.

Queremos ter muito cuidado para não introduzir bolhas de ar no dispositivo, pois, caso contrário, o dispositivo apresentará mau funcionamento. Assim, normalmente pegamos a seringa e empurramos o êmbolo, adicionando o líquido à superfície superior do dispositivo, certificando-nos de que esteja completamente preenchido antes de ejetar todo o líquido. Paramos e removemos cuidadosamente o corpo da seringa da agulha, preenchendo basicamente a ponta da agulha ou o conector de acoplamento da agulha com o tampão remanescente dentro da seringa.

Nós descartamos isso. Em seguida, vamos pegar nossa seringa com sangue e inseri-la neste conector. Tendo cuidado para não derramar o sangue e para não introduzir bolhas de ar.

É preferível usar uma pinça para segurar o corpo da seringa e o tubo, caso haja derramamento de sangue. Uma vez que a seringa é conectada ao alojamento do tubo ou à agulha, damos algumas batidas firmes para remover quaisquer bolhas de ar que possam estar presentes no conector. Em seguida, esta seringa é colocada na bomba de infusão e fixada com o parafuso de travamento.

A bomba de seringa é ligada e já está predefinida para as nossas condições de fluxo. Vamos fazer passar este sangue através do dispositivo a 30 microlitros por minuto. Uma vez que o corpo da seringa é carregado na bomba de seringa, vamos pressionar o botão no braço móvel do êmbolo e deslizá-lo para baixo até tocar o topo do êmbolo e começar a empurrar o fluido para fora pela ponta disto.

É uma agulha de aço inoxidável com ponta romba. Assim que soubermos que o sistema está preparado, vamos pressionar iniciar. Para começar o fluxo de sangue, pressione parar para interrompê-lo e, em seguida, pegue um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL ou tubo fendor e vamos desconectar cuidadosamente.

Desconecte apenas um, desconecte o tubo de uma das portas do dispositivo. Uma vez que este tubo for desconectado, inserimos nele o tubo fendor de 1,5 mil. Pressionaremos executar para reiniciar o fluxo sanguíneo novamente.

E quando vemos uma gota de sangue se formar, paramos a bomba e a inserimos na entrada que acabamos de abrir no dispositivo. Pressionaremos executar para iniciar o fluxo de sangue e configuraremos um temporizador para cinco minutos. Queremos garantir que o sangue preencha igualmente todas as câmaras e que não haja bolhas de ar evidentes no dispositivo.

Se houver bolhas de ar bloqueando o fluxo para qualquer uma das câmaras, você pode pegar um par de pinças e passá-las ao longo dos pequenos canais que levam até as câmaras de captura ou aos pequenos canais que saem das câmaras de captura. Este dispositivo está preenchendo bem, então, após cinco minutos, pressione parar na bomba de seringa para interromper o fluxo de sangue, solte o clipe da seringa e retire-a do suporte da bomba de seringa. Em seguida, usaremos a seringa número três, que está carregada com PBS livre de nucleases. Vamos usar, basicamente, novamente garantir que a superfície do dispositivo esteja bem assentada para evitar quaisquer bolhas de ar; vamos bater na seringa para garantir que quaisquer bolhas de ar fiquem na parte superior do corpo da seringa.

Solte o braço da bomba de seringa e insira a seringa de três mililitros na bomba. Aperte-a e, em seguida, empurre o êmbolo até que entre em contato com o êmbolo da seringa. Acionamos o botão de execução e aguardamos o líquido preparar o dispositivo, até observarmos uma gota na ponta da agulha de aço inoxidável.

Quando você vir uma gota se formando, pare a bomba. Vamos remover o sangue, a ponta de aço inoxidável que contém o sangue. Vamos inserir o tampão de lavagem e pressionar executar.

E vamos deixar isso funcionar por cinco minutos. Você deve pegar um lenço limpo e limpar qualquer pequena quantidade de sangue que possa estar presente na entrada ou na saída. Após cinco minutos de passagem do tampão de lavagem pelo dispositivo, o dispositivo deverá estar completamente livre de qualquer vestígio de sangue, o que pode ser verificado visualmente pela ausência de sangue vermelho no dispositivo, que parecerá transparente. Então, o que vamos fazer após os cinco minutos é interromper a passagem do tampão de lavagem.

E novamente, vamos retirar a seringa da bomba de infusão. Vamos tampar o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL diretamente na tubulação de saída flexível. E vamos levantar cuidadosamente o tubo, o tubo de microcentrífuga, puxando a tubulação de resíduos para fora do dispositivo.

Vamos descartar isso em um recipiente de biohazard. O kit contém um novo tubo de saída, que na verdade é feito de teflon. Ele possui novamente uma ponteira de aço inoxidável.

Vamos substituir a tubulação de saída antiga por esta nova tubulação de saída. Vamos pegar essa tubulação de saída e tentar dobrá-la em um formato semelhante a um U ou a um V. Além disso, o kit inclui uma coluna kaya shredder, que fragmenta o DNA e basicamente homogeneiza o seu lisado celular.

Então vamos abrir a tampa roxa da coluna trituradora e posicionar o tubo de saída na coluna Kay Shredder. Vamos retirar do kit a seringa número dois, indicada para RLT, que será utilizada. Trata-se de uma seringa BD padrão de um mililitro, com ponta cega de aço inoxidável, calibre 22.

Vamos usar isso para injetar 350 microlitros do padrão RLT da kyogen no dispositivo. Como o dispositivo possui um volume morto de cerca de 50 microlitros, o que queremos fazer é injetar o RLT, mas atrás do RLT, desejamos injetar um tampão de ar para liberar esse volume morto do dispositivo na coluna do chi shredder. Então, o que faremos é pegar nossa seringa, puxar e aspirar 350 microlitros de ar e, em seguida, 350 microlitros ou 0,35 mililitros de RLT, sendo que o RLT agora está na parte inferior da seringa.

Resista à tentação de virar a seringa e injetar o ar. O ar está presente para garantir que coloquemos todo o RLT na nossa coluna Kay shredder. Vamos retirar o tubo do tampão de lavagem.

Vamos inserir nossa seringa com o RLT e vamos injetar lentamente o RLT no dispositivo ao longo de aproximadamente 30 segundos, certificando-nos de que a tubulação de saída esteja descartando seu resíduo na coluna do triturador Chi. Quando o ar começar a ser injetado no dispositivo, pressione o êmbolo e aguarde até que todo o fluido seja liberado na coluna do triturador Kay. Fechamos a coluna do triturador Kay e a centrifugamos em uma microcentrífuga com balanceamento a 15.000 RPM ou à velocidade máxima de uma microcentrífuga de bancada por dois minutos.

Após centrifugar a coluna por dois minutos, vamos retirar a amostra, que agora está em RLT, e colocá-la em um dos tubos criogênicos fornecidos com tampa roxa. Se você estiver trabalhando com uma amostra clínica, rotule esses tubos criogênicos no início do experimento. Aqui está o lisado no tubo criogênico.

Este tubo criogênico é imediatamente colocado em um congelador a -80 graus Celsius e armazenado para envio ou extração posterior de RNA. Este é, portanto, um protocolo alternativo para o isolamento de neutrófilos. Em vez de lisar as células com o tampão RLT, vamos corá-las com um corante histológico padrão.

Uma mancha. Então retiramos o dispositivo selado da bolsa e o desembrulhamos novamente, anotamos o número do lote no dispositivo e colocamos a placa de Petri no suporte da placa de Petri.

Vamos pegar a seringa de um mililitro da sua embalagem, seringa número um, vamos carregá-la com 700 microlitros de sangue e injetar metade disso, 350 microlitros, em um tubo eppendorf DPH. Vamos reservar esse tubo. Pegue a seringa quatro, que possui o tubo que usaremos para a seleção, e injete o sangue no dispositivo.

Vai segurar a base da agulha a partir da ponta do tubo de maneira química. Retire o corpo da seringa e encha a cânula. O adaptador irá tamponar e descartar essa seringa.

Inseriremos a seringa contendo sangue na agulha, utilizando o lenço químico para coletar qualquer derramamento. Sacudiremos a seringa para remover quaisquer bolhas de ar na conexão entre a agulha e o corpo da seringa. Carregaremos a seringa na bomba de infusão, e primaremos o tubo empurrando para baixo o braço móvel da bomba de seringa.

Vamos desconectar a tubulação de uma das saídas do dispositivo, o dispositivo de captura, e colocá-la em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Em seguida, iniciaremos o fluxo de sangue pressionando "run" na bomba de seringa. Aguardaremos a formação de uma gota de sangue na ponta de aço inoxidável.

Uma vez formado o gotículo, pressione parar, seque esse sangue, insira-o no dispositivo e pressione iniciar. Agora, configure um cronômetro para cinco minutos. Pronto, após fluir pelo dispositivo por cinco minutos, pressione parar na bomba de seringa e libere a seringa.

E vamos substituir essa seringa pela seringa de três mil contendo nosso tampão de lavagem, que é apenas um XPBS. Novamente, queremos garantir que a parte superior do dispositivo esteja vedada e, em seguida, vamos remover a ponta da agulha contendo sangue ou mais solução. Iniciar o escorvamento do dispositivo.

Vamos formar gotículas, inseri-las no dispositivo e pressionar para executar; remova qualquer sangue presente no tubo de entrada ou saída e deixe o fluxo ocorrer por cinco minutos após a etapa de lavagem. Novamente, pare a bomba de seringa e remova a seringa do suporte da bomba. Para realizar a manutenção padrão do GIM, primeiro vamos fixar as células e desidratá-las usando metanol a 100%.

Então, temos uma seringa, uma seringa de três mililitros pré-carregada com metanol. Novamente, vamos escorar a seringa, garantir que o metanol esteja fluindo, parar a bomba de infusão, inseri-la no dispositivo e pressionar iniciar. Vamos fixar as amostras nesta solução de metanol por dois a quatro minutos.

Após dois a quatro minutos de fixação com metanol, interrompemos a bomba, removemos a seringa contendo metanol e, em seguida, carregamos uma seringa de três mililitros contendo eem sustain padrão eem sustain da Sigma, diluído na proporção de um para cinco em água desionizada. Após a diluição, carregamos a solução na seringa e, na extremidade da seringa, acoplamos um filtro de 0,8 mícron para remover quaisquer partículas que possam entupir o dispositivo. A coloração dura de cinco a dez minutos.

Em seguida, enxaguaremos com água desionizada. Após cinco a 10 minutos de coloração, interromperemos a bomba de seringa e substituiremos a seringa contendo o tampão de coloração pela seringa que contém água desionizada, lavando basicamente até observarmos que a cor azul do SAI tenha sido removida do dispositivo. Uma vez que o excesso de gim sustain tenha sido removido por enxágue do dispositivo, interrompemos a solução de lavagem.

E então o que vamos fazer é remover a seringa de água da entrada. Em seguida, vamos pegar o tubo de saída do dispositivo. Vamos segurar esse tubo na extremidade com nossas pinças.

Este é um tubo flexível de tigon que vamos inserir novamente na entrada do dispositivo. Isso selará o dispositivo e manterá as células hidratadas e sua morfologia intacta. Agora, meu colega de trabalho, Dr. John Hong Chang, mostrará um protocolo alternativo para o isolamento de linfócitos positivos para CD4, seguido por coloração imunofluorescente diretamente dentro do dispositivo microfluídico.

Meu nome é Shong Hong e hoje vou demonstrar a coloração celular em um dispositivo microfluídico. Neste estágio, já é possível mostrar como usar um dispositivo de isolamento por imunoafinidade microfluídico para isolar especificamente células sanguíneas diretamente de sangue total, sem precedentes. Para esse objetivo, ele deseja lise as células e obter o conteúdo proteico e de DNA dessas células isoladas. No entanto, para os fins da minha pesquisa, estou interessado em obter as células e, em seguida, realizar a contagem celular, por exemplo, determinar a contagem de células CD4 a partir de sangue total e utilizar esse valor como um indicador para fins diagnósticos.

Assim, o dispositivo utilizado é muito semelhante ao dispositivo de Ken. É feito de uma câmara reta de PDMS-A. A geometria é ligeiramente diferente, portanto os parâmetros de operação são ligeiramente distintos, embora, em geral, o procedimento operacional global seja muito semelhante.

Então, vou pular todos os passos de captura e lavagem celular e avançar diretamente para a etapa de coloração celular nos procedimentos de contagem de células. Aqui tenho um dispositivo no qual já há metade das células capturadas a partir de sangue total, e o dispositivo já foi lavado com PBS. As células não retidas já foram removidas do dispositivo, e preparei previamente uma mistura de anticorpos utilizada especificamente para marcar as células que foram isoladas no dispositivo.

Portanto, a concentração de anticorpo que utilizamos aqui foi otimizada para colorar as células com intensidade fluorescente muito alta ao microscópio fluorescente. Assim, o procedimento é bastante simples. Carregamos a seringa preenchida com a solução de anticorpo na bomba de seringa e, em seguida, certificamo-nos de que a taxa de fluxo está ajustada aos parâmetros corretos de que necessitamos.

Em seguida, iniciaremos a bomba de seringa e observaremos a extremidade da tubulação, garantindo que a solução já esteja saindo, de modo que não haja mais bolhas dentro da tubulação. Então, podemos conectar a tubulação ao dispositivo microfluídico no qual temos as células capturadas. Agora, o anticorpo está fluindo para o dispositivo para marcar as células que isolamos dentro do dispositivo. A vazão aqui é de cinco microlitros por minuto, mas, dependendo da geometria do dispositivo, podem haver diferentes parâmetros de fluxo que você deseja utilizar para seu propósito.

E vamos fazer fluir a solução de anticorpo por cinco minutos, o que é suficiente para substituir todo o volume da solução dentro do canal microfluídico. Assim, após a injeção do anticorpo, interromperemos o fluxo. Então, infundimos o anticorpo a cinco microlitros por minuto durante cinco minutos para substituir toda a solução dentro do microcanal.

Em seguida, interrompemos o fluxo e deixamos o dispositivo em incubação à temperatura ambiente por 30 minutos. Isso deve ser feito no escuro para que o anticorpo não seja quenchado enquanto as células são incubadas com o anticorpo marcado com fluoróforo, já que esses anticorpos fluorescentes podem sofrer quenching. Após a coloração, que normalmente dura de 15 a 30 minutos, basta desconectar a tubulação do dispositivo e substituir a seringa de anticorpo por uma seringa contendo tampão, a fim de remover o anticorpo não ligado do dispositivo.

Então, a solução de lavagem aqui contém 1% de BSA em solução PBS. A BSA é usada para bloquear a ligação não específica do anticorpo na superfície, e faremos a mesma coisa. Primeiro, ajustamos a taxa de fluxo na bomba de seringa para garantir que seja a taxa de fluxo desejada, e então iniciamos a bomba de seringa, verificando se há efetivamente líquido saindo da tubulação antes de conectá-la ao dispositivo.

O objetivo de fazer isso é garantir que não reste nenhuma bolha residual na tubulação. Assim, quando realizamos a injeção, nenhuma bolha entra no nosso dispositivo. Portanto, basta conectar a tubulação ao dispositivo e deixar o fluxo ocorrer por mais cinco minutos, a fim de substituir completamente o material lavado, ou seja, todo o anticorpo não ligado proveniente do dispositivo.

Após a etapa de lavagem, fixaremos as células com PFA a 1%. O objetivo disso é permitir que o dispositivo seja armazenado por algumas semanas, caso a imagem seja realizada imediatamente. Assim, o procedimento é bastante simples.

É semelhante ao que fizemos anteriormente. Carregamos a seringa na bomba, ajustamos a taxa de fluxo para o valor desejado e, em seguida, iniciamos a bomba de seringa e conectamos o tubo ao nosso dispositivo para injetar a solução de paraformaldeído, que é o fixador, no interior do dispositivo para fixar as células. Novamente, deixamos fluir por cerca de cinco minutos.

Portanto, o PFA substitui todo o tampão no dispositivo para fixar todas as células nele presentes. Assim, após a etapa de fixação com PFA, basta remover a seringa de PFA e o dispositivo está pronto para a aquisição de imagens. Em alguns casos, as pessoas desejam realizar uma coloração do núcleo para sobrepor à coloração do marcador de superfície celular.

Para esse fim, será realizada a coloração do núcleo utilizando DPI no final. Assim, basta carregar a seringa com DPI, ligar a bomba de seringa e fazer o DPI fluir através do nosso dispositivo. Agora, o núcleo será corado nessas células, evidenciando a localização das células.

E esta imagem da coloração com DPI pode posteriormente ser sobreposta à coloração do marcador de superfície para mostrar onde estão as células. Assim, ao final da coloração com DPI, precisamos novamente lavar o DPI ligado com solução tampão. Mais uma vez, estamos usando PBS contendo 1% de BSA para lavar o DPI não ligado.

E o procedimento é semelhante ao que fizemos anteriormente. Basta conectar a seringa do tampão ao nosso dispositivo e permitir que o tampão flua através do dispositivo para remover o dap não ligado. Esse é todo o procedimento de marcação de células em um dispositivo microfluídico.

E após todos os procedimentos de coloração, os dispositivos estão prontos para a aquisição de imagens. E como realizamos a fixação com PFA, os dispositivos também podem ser armazenados por algumas semanas, caso a aquisição de imagens não possa ser realizada imediatamente.