Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

O objetivo geral deste procedimento é inferir a tropismo viral em um paciente infectado pelo HIV por meio do sequenciamento da região V3 do gene do envelope viral, começando com a extração do RNA do HIV do plasma sanguíneo do paciente. Em seguida, amplifique a região V3 da GP120 do HIV utilizando RT-PCR aninhada. Então, identifique a presença do produto por meio de eletroforese em gel, seguida de sequenciamento baseado em população dos produtos V3 amplificados.

Finalmente, analise as sequências utilizando um software de chamada de bases e infira o uso do co-receptor usando o algoritmo de genoma para fenótipo. Em última análise, esses resultados podem demonstrar se a tropismo viral de um paciente é R5 ou não R5 por meio do sequenciamento baseado em população do loop V3 do HIV. Assim, a principal vantagem desse método de ensaio de tropismo em relação aos métodos existentes, como ensaios fenotípicos baseados em células, é que ele pode ser realizado em qualquer laboratório equipado com aparelho de sequenciamento, com custo reduzido, em menor tempo e com menor quantidade de material inicial.

Essa técnica é relevante para o tratamento com terapia antirretroviral porque pode identificar se a população viral de um paciente provavelmente responderá a um antagonista de CCR5. A partir de 500 microlitros de plasma, utilize um extrator automatizado easy mag para extrair o RNA do HIV. Em seguida, dirija-se a um laboratório limpo para PCR para montar a RT-PCR, a fim de garantir uma amostragem adequada da população viral.

Planeje realizar cada reação de transcrição reversa em triplicata nesta reação de um único passo. Use RNA viral para sintetizar cDNA, amplificando especificamente a região HIVV três com o SQV três F1 e a reparação do CO 6 0 2 prime. Com base nos componentes por reação.

Prepare uma solução estoque suficiente para o número de amostras a serem amplificadas, utilizando uma pipeta repetidora. Adicione 36 microlitros da mistura de amostra a cada poço da placa de PCR. Agora, mude para uma pipeta multicanal para transferir microlitros do extrato da amostra de RNA para cada um dos poços designados. Tenha o cuidado de trocar as ponteiras entre cada adição.

Após a conclusão da transferência, cubra os poços com tampas de fita para PCR. Em seguida, coloque a placa de PCR em um termociclador programado para uma reação de RT-PCR em um único passo da região três do HIVV. Para a PCR aninhada, utilize o reparo do iniciador SQV três F dois e CD quatro R.

Calcule a quantidade de reagente necessária para o número de amostras a serem amplificadas em uma sala limpa de PCR. Prepare a mistura de PCR aninhada e, em seguida, use uma pipeta repetidora para aliquotar 19 microlitros por poço de uma placa de PCR limpa. Após a conclusão da R-T-P-C-R, transfira-se para uma sala pós-amplificação.

Use uma pipeta multicanal de oito canais para transferir um microlitro do molde de R-T-P-C-R para a mistura de PCR aninhada. Troque as ponteiras entre cada adição. Cubra os poços com tampas em tira para PCR e transfira a placa para um termociclador para amplificação.

Remova a placa do termociclador após a temperatura ter retornado a 25 graus Celsius. Para confirmar que a região V três foi amplificada com sucesso, analise primeiro os produtos por eletroforese em gel. Prepare um gel de 1,6% de AROS com corante para gel cyber safe.

Usando uma pipeta multicanal de 10 microlitros. Transfira amostras de PCR de oito microlitros para os poços respectivos. Também carregue um marcador de DNA em pelo menos um poço por linha.

Execute o gel a aproximadamente 100 volts durante 10 minutos. Visualize as bandas por fluorescência ultravioleta e documente a imagem por meio de fotografia. Registre os exemplos em que todas as amplificações em triplicata foram bem-sucedidas.

Se necessário, repita a R-T-P-C-R para as amostras com menos de três amplificações do produto. As amostras amplificadas de cDNA viral são posteriormente verificadas por reações de sequenciamento de DNA, que serão realizadas utilizando os iniciadores V 3 0 2 F e S QV três R um. Remova o reagente big di do congelador e descongele à temperatura ambiente.

Calcule e prepare os reagentes necessários para o número de amostras a serem analisadas. Aliquote cinco microlitros da mistura de reação de sequenciamento nos poços apropriados da placa utilizando uma pipeta multicanal. Cubra a placa com uma toalha de papel Kim e reserve-a.

Enquanto isso, prepare uma diluição de um para 15 do produto PCR amplificado adicionando 180 microlitros de água estéril ao produto PCR remanescente. Pipete um microlitro da amostra diluída até o fundo da placa apropriada. Sempre troque as ponteiras entre amostras quando a transferência da amostra estiver concluída.

Selar a placa com tampas em tira e vortex por um segundo. Para centrifugar a placa, ajustar a velocidade em 140 5G. Quando a velocidade de rotação atingir 140 5G, interromper a centrifugação.

Coloque a placa em um termociclador para que a reação prossiga. Em cada poço, precipite o DNA com quatro microlitros de acetato de sódio 3 molar e 40 microlitros de etanol 95% gelado, e feche novamente as tampas. Centrifugue a placa por 10 segundos e bata levemente na placa para desprender quaisquer bolhas de ar.

Coloque as placas a menos 20 graus Celsius por entre 30 minutos e duas horas. Recupere o DNA por centrifugação a 2000 G durante 20 minutos. Remova e descarte as tampas em tiras.

Inverta a placa sobre o recipiente de resíduos e decante o sobrenadante. Remova qualquer sobrenadante remanescente, pressionando suavemente as placas invertidas sobre uma toalha de papel.

Dobre duas folhas de papel-toalha para envolver a placa. Coloque a placa voltada para baixo na centrífuga e gire a 140 5G. Pare a rotação quando atingir 140 5G.

Em seguida, lave com 155 microlitros de etanol a 95% e decante. Repita, então, a centrifugação. Deixe a placa em repouso por dois a cinco minutos para permitir a evaporação de qualquer resíduo de etanol.

Para desnaturar as amostras de DNA, utilize uma pipeta multicanal para distribuir 10 microlitros de corante concentrado para maide em todos os poços da placa, incluindo aqueles que estão vazios. Selle a placa com uma septa e coloque no termociclador a 90 graus Celsius por dois minutos. Por fim, coloque a placa de amostras em uma placa de sequenciamento e no sequenciador.

Uma rota aceitável para a análise de dados é o uso do software Recall para realizar chamada automática de bases sem intervenção humana. O Recall é um software gratuito baseado em chamadas; faça login e selecione os arquivos de amostra para upload com a opção de navegação. Localize o arquivo de dados de sequenciamento bruto e faça upload de até 20 megabytes.

Em seguida, defina a sequência de referência como V três. Clique em processar dados. Selecione a pasta resultante no lado direito da página para exibir a lista de amostras.

Os que são vermelhos falharam. Os que são verdes foram aprovados. Ao clicar em uma amostra específica e no botão visualizar, é possível revisar a sequência, seguir as instruções no lado direito da página para navegar pela sequência e baixar arquivos em uma pasta compactada zip.

O tropismo viral pode ser inferido a partir de sequências geradas por sequenciamento baseado em população, utilizando o algoritmo genótipo para fenótipo de co-receptor. No menu suspenso da configuração significativa, selecione a opção otimizada com base na análise de dados clínicos de motivate 2% e 5,75% FPR. Agora, escolha fazer upload ou colar uma sequência para análise.

Arquivos FASTA são aceitáveis. Não adicione outros procedimentos para obter um preditor genotípico FPRA de resposta a antagonistas do CCR cinco. O relatório G dois P gerado fornece a sequência do loop V três em aminoácidos e indica posições relevantes de mutações associadas a vírus não R cinco.

No final do relatório, a taxa de falsos positivos é apresentada e interpretada em termos de resposta a um antagonista de CCR5. Este relatório pode ser baixado como um arquivo PDF. Se alguma das três sequências de uma amostra for inferida como não R5, o paciente provavelmente não responderá a um antagonista de CCR5 conforme o esperado. A eletroforese em gel de amplificações de RT-PCR do loop V3 do HIV-1 indica que nem todas as amostras clínicas produzem um produto.

As sequências geradas a partir das amostras amplificadas podem ser visualizadas em um cromatograma lido por meio de recuperação. Espera-se uma sequência limpa, com poucas misturas. Ocasionalmente, as sequências podem ser confusas e não adequadas para a atribuição precisa das bases.

Alguns pacientes podem ser identificados como portadores de vírus que não utilizam CCR5, conforme mostrado aqui. Esses pacientes provavelmente não responderão ao tratamento com um antagonista de CCR5. No entanto, a maioria dos pacientes apresenta uma população viral composta por vírus que utilizam CCR5, conforme indicado por uma caixa verde na parte inferior do relatório de análise G2P.

Assim, uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro dias do início ao fim, ou seja, da extração até a análise. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como prever o tropismo viral utilizando métodos de sequenciamento baseados em populações em conjunto com o algoritmo bioinformático genome pheno.

Muito bem, é isso. Agradecemos por assistir e desejamos boa sorte com seus experimentos.