A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a

O objetivo geral deste procedimento é inserir genes gag derivados de indivíduos infectados pelo HIV1 subtipo C em um plasmídeo de HIV1 com capacidade de replicação, a fim de avaliar o efeito de polimorfismos na sequência de gag sobre a capacidade de replicação do HIV1 in vitro. Isso é realizado primeiramente amplificando o gene gag a partir do plasma do paciente. O segundo passo consiste em clonar a sequência de gag derivada do paciente no clone molecular infeccioso competente para replicação MJ-four. Em seguida, o plasmídeo quimérico gag-MJ-four é transfectado para gerar estoques virais infecciosos, que são titulados para avaliar a infectividade em uma linhagem celular indicadora. O passo final é medir a capacidade de replicação in vitro na linhagem celular T GXR-25. Por fim, um ensaio de transcriptase reversa marcado com radionuclídeo é utilizado para quantificar a produção de viriões ao longo do tempo, permitindo visualizar a cinética de replicação viral.

O método que vamos descrever hoje pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do HIV. Essas incluem definir os determinantes da aptidão replicativa do HIV e compreender como a aptidão do HIV afeta a patogênese a longo prazo. Descrevendo os métodos hoje estarão Jessica Prince e Dan Claiborne, dois dos meus alunos de pós-graduação.

Para iniciar este procedimento, realize a transcrição reversa de cDNA a partir de RNA e amplifique os produtos de DNA da primeira rodada utilizando transcriptase reversa e uma DNA polimerase termoestável em uma reação de RT-PCR em um único passo. Em seguida, usando um microlitro da amplificação PCR da primeira rodada como molde de DNA, realize uma amplificação PCR aninhada de segunda rodada. A seguir, adicione três microlitros de corante carregador 5X a cinco microlitros do volume da reação da segunda rodada.

Execute-o a 120 volts em um gel de agarose 1% TAE contendo um corante fluorescente de DNA para UV até que as bandas sejam resolvidas. Em seguida, visualize as bandas de 1,6 kb em um iluminador de luz azul. Depois disso, execute o volume restante da reação de 45 microlitros em um gel de agarose 1% TAE contendo o corante de DNA. Recorte as bandas apropriadas com uma lâmina de barbear limpa e combine três reações positivas por indivíduo. Posteriormente, extraia o DNA do fragmento de gel usando um kit de purificação de gel e elua-o em água livre de nucleases. Congele o produto a menos 20 graus Celsius para uso posterior. 0:15:56 Neste procedimento, após amplificar a região do LTR cinco prime UTR do plasmídeo MJ-quatro, visualize os produtos de PCR de 1,3 kb no iluminador. Recorte os amplicons positivos, purifique-os e congele-os conforme descrito anteriormente. Em seguida, crie os amplicons fundidos LTR-gag do MJ-quatro por meio de PCR de extensão com sobreposição de splice. Visualize, recorte, purifique e congele o amplicon longo de 3,2 kb. Agora, digira 1,5 microgramas do plasmídeo MJ-quatro e 1,5 microgramas do produto de PCR LTR-gag purificado com a endonuclease de restrição BCL-um por 1,5 hora a 50 graus Celsius. Posteriormente, adicione um microlitro de NGOM-quatro à reação de digestão e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora. Depois disso, adicione corante de carregamento 5x às reações de digestão por restrição. Realize lentamente a eletroforese do volume total em um gel de agarose 1%, TAE, contendo um corante de DNA por uma a duas horas a 100 volts. Visualize, recorte e purifique as bandas indicadas para clonagem conforme descrito anteriormente.

Em seguida, prepare as reações de ligação utilizando o inserto purificado LTR-gag e o DNA do vetor MJ-four numa proporção de três para um de inserto em relação ao vetor. Incube as reações de ligação durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, transforme bactérias JM-109 quimicamente competentes com os produtos de ligação espalhados em placas de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as bactérias transformadas a 30 graus Celsius por pelo menos 22 horas. Para confirmar a fidelidade da clonagem, digira o DNA de mini-prep com as enzimas de restrição NGOM-quatro e HPA-um em um digestão dupla a 37 graus Celsius por duas horas.

Posteriormente, analise em um gel de agarose 1% em tampão TAE. Calcule o volume de vírus necessário de cada estoque com base na titulação em UI por microlitro obtida em ensaio com células TZM-BL, a fim de infectar cinco vezes 10 à quinta potência de células GXR-25 com uma multiplicidade de infecção de 0,05. Certifique-se de utilizar equipamento de proteção individual adequado para trabalho com HIV capaz de replicação, o que inclui jaleco completo, máscara facial e luvas duplas. No dia da infecção, retire os estoques de vírus do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele. Em seguida, dilua o vírus em meio C-R-P-M-I até um volume de 100 microlitros, de modo a obter um MOI de 0,05. Adicione ao poço em formato de V, tratado para cultura de tecidos, de uma placa de 96 poços, incluindo tanto um controle positivo quanto um controle negativo em cada conjunto de experimentos de replicação, e monte a placa de forma que a cada outro poço esteja vazio, limitando assim a contaminação cruzada entre poços. Posteriormente, conte as células GXR-25 utilizando um contador automático de células e calcule o número total de células necessário para todas as infecções. Aliquote o volume necessário em um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue para obter o pellet celular. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio e ressuspenda em C-R-P-M-I numa concentração de cinco vezes 10 à quinta potência de células por 100 microlitros. Pipete as células em um reservatório estéril e misture completamente. Subsequentemente, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de células em cada poço da placa de 96 poços contendo o vírus diluído e misture completamente. Depois disso, adicione dois microlitros de solução de polibreno a cinco miligramas por mililitro em cada poço e misture bem as células. Incube então a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% de CO2 por três horas.

Para lavar as células infectadas, centrifugue a placa de fundo V de 96 poços para formar o pellet celular. Em seguida, remova cuidadosamente 150 microlitros do meio e substitua por 150 microlitros frescos de C-R-P-M-I sem perturbar o pellet celular. Repita o procedimento mais duas vezes para lavar adequadamente as células. Após a última centrifugação e a adição de 150 microlitros de C-R-P-M-I, ressuspenda o pellet celular com uma pipeta multicanal. Adicione a mistura de cada poço a 800 microlitros de C-R-P-M-I em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius. A cada dois dias, transfira 100 microlitros do sobrenadante da superfície do poço de cultura para um poço de uma placa de fundo U de 96 poços e congele para análise subsequente utilizando o ensaio de RT. Em seguida, ressuspenda completamente as células e remova metade do volume restante para evitar o crescimento excessivo celular. Depois disso, restabeleça o volume original adicionando 550 microlitros de C-R-P-M-I fresco a cada poço.

Neste procedimento, adicione um a dois microlitros de DTTP a 10 milicurie por mililitro e quatro microlitros de DTT a um molar a cada alíquota de um mililitro da mistura mestra de RT. Misture cuidadosamente cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo a mistura mestra de RT, DTT e DTTP com uma pipeta de 1000 microlitros e transfira para um recipiente estéril.

A seguir, distribua 25 microlitros da mistura de RT rotulada em cada poço de uma placa PCR de 96 poços com paredes finas. Adicione cinco microlitros de cada sobrenadante à placa PCR contendo a mistura mestra de RT. Em seguida, sela a placa PCR com uma tampa de folha adesiva e incuba por duas horas a 37 graus Celsius em um termociclador. Após a incubação, faça pequenos furos na tampa de folha usando uma pipeta multicanal de 200 microlitros. Misture as amostras cinco vezes. Transfira cinco microlitros de cada amostra para papel DE-81 e deixe todas as amostras secarem ao ar por 10 minutos. Coloque as manchas em recipientes de lavagem separados. Posteriormente, lave as manchas cinco vezes com SSC 1X. Depois, duas vezes com etanol a 90% por cinco minutos por lavagem antes de deixá-las secar ao ar. Uma vez secas, envolva cuidadosamente a mancha em filme plástico e exponha-a à tela fosforescente em um cassete hermético durante a noite à temperatura ambiente.

Uma vez prontos, analise as telas de fosforilação com um fosfoimager e quantifique os transcritos radioativos.

Apresentadas aqui estão as imagens representativas dos géis que mostram a separação eletroforética dos diversos amplicons de PCR necessários para gerar um amplicon de gag derivado de paciente, capaz de ser clonado no vetor plasmidial MJ-four. Esta imagem representativa de gel mostra a separação eletroforética dos digestos de restrição para clonagem dos genes gag de pacientes no MJ four.

E esta imagem representativa de gel mostra a separação eletroforética de digestões com enzimas de restrição de um DNA plasmidial purificado do quimera gag MJ-quatro. Este gráfico mostra a reprodutibilidade do ensaio de replicação ao longo do tempo na linhagem celular GXR-25. Os mesmos vírus quiméricos gag MJ-quatro foram utilizados para infectar células GXR-25 em dois experimentos independentes realizados aproximadamente um ano após o outro.

Os escores de replicação foram gerados calculando a inclinação dos valores de DLU transformados em log e normalizando essa inclinação ao tipo selvagem MJ-quatro. As duas medições independentes são fortemente correlacionadas e destacam a reprodutibilidade dos ensaios realizados em momentos diferentes e com células em diferentes passagens. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de HIV AIDS explorarem os determinantes virais da patogênese, na infecção aguda pelo subtipo C, o subtipo mais prevalente no mundo. Trabalhar com HIV capaz de replicação pode ser extremamente perigoso. Todas as etapas que envolvem vírus vivos devem ser realizadas em uma instalação BSL dois mais. Todas as superfícies devem ser descontaminadas regularmente e luvas duplas devem ser usadas em todos os momentos.