Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

O objetivo geral deste procedimento é manipular células e microesferas em dispositivos microfluídicos utilizando eletrorotação ou DEP com placas de circuito impresso, ou PCBs. Isso é realizado primeiramente projetando e preparando os eletrodos de PCB e os canais microfluídicos. O segundo passo do procedimento consiste em preparar a montagem microfluídica de PCB e as soluções de microesferas e células.

O terceiro passo do procedimento é preencher os canais com meio de baixa condutividade, em seguida carregar as microesferas e as células. O passo final do procedimento é conectar a montagem de PCB ao amplificador de potência e ao gerador de funções, e então iniciar a DEP. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a separação e manipulação de células e microesferas em dispositivos microfluídicos por meio do uso da DEP.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque os princípios da DEP devem ser compreendidos pelo usuário para desenvolver um eletrodo eficaz que funcione com dispositivos microfluídicos para a manipulação desejada de células ou microesferas. Por outro lado, o uso de PCBs como eletrodos torna a atuação de células e microesferas em dispositivos microfluídicos acessível a diversas disciplinas científicas. O primeiro passo deste procedimento é projetar os eletrodos de placa de circuito impresso ou PCB com a geometria desejada para gerar um campo elétrico não uniforme.

Quando o projeto estiver concluído, solicite os chips de eletrodos de PCB personalizados por meio de uma empresa comercial de fabricação. Após a chegada do PCB personalizado, abra-o e inspecione-o para esta demonstração. O PCB tem 8,4 centímetros de comprimento e 2,1 centímetros de largura.

Os eletrodos metálicos têm cinco milímetros de largura. Neste exemplo, os eletrodos possuem duas tiras metálicas longas e duas regiões transversais de 4,5 milímetros de comprimento onde os eletrodos são interdigitados. Essas regiões interdigitadas geram um campo elétrico não uniforme intenso para criar uma conexão do estimulador ao eletrodo do PCB.

Coloque um fio de calibre 16 na extremidade do eletrodo. Use um ferro de solda quente para segurar o fio no lugar na área metálica da PCB. Isso aquece o fio.

Segure a solda junto ao fio aquecido e permita que uma pequena quantidade de solda entre no fio. Após o fio ser preenchido com solda, remova o ferro de solda mantendo o fio no lugar enquanto a solda esfria. Repita o processo de soldagem para a outra conexão elétrica na PCB.

O próximo passo é preparar canais microfluídicos com o padrão de ramificação desejado. Utilizando técnicas padrão de microfabricação, crie um molde mestre para definir os canais usando uma pastilha de silício e o fotoresiste SU eight. Este molde mestre possui um canal de entrada e três canais-alvo.

A largura dos canais é de 100 micrômetros, e a altura dos canais é de 27 micrômetros. Após a criação do molde mestre, misture o elastômero de polimetil LAANE ou PDMS com um agente de cura na proporção de 10 para 1 em peso por cinco minutos. Despeje o PDMS líquido sobre o molde mestre SU oito pré-fabricado e remova as bolhas de ar expondo o PDMS líquido ao vácuo por três minutos.

Repita o processo de vácuo, se necessário, para remover completamente todas as bolhas. Um fluxo de gás nitrogênio pode ser usado para remover bolhas adicionais, se necessário. Cure o PDMS em uma estufa a 70 graus Celsius por duas horas.

Use uma lâmina de barbear para remover o laboratório P-D-M-S-S com os canais microfluídicos da pastilha. Tenha cuidado para não quebrar a pastilha com o espaço do canal virado para cima. Use um furador de biópsia para fazer furos destinados à introdução de fluidos e células no dispositivo microfluídico. Apare.

Qualquer excesso de PDMS. Inspecione o dispositivo microfluídico para garantir que esteja livre de poeira e detritos. Use fita adesiva 3M Scotch Magic para limpar o PDMS.

Exponha os canais de PDMS e uma lamínula limpa número zero com espessura entre 80 e 130 micrômetros ao gás de plasma por 1,5 minuto. Remova o laboratório de PDMS e a lamínula do limpador de plasma em uma placa de Petri; una por ligação de plasma os canais microfluídicos de PDMS com a face voltada para baixo sobre a lamínula. Aqueça o conjunto microfluídico de lamínula em uma placa aquecida ajustada a 100 graus Celsius por um mínimo de 15 minutos. O passo final na preparação do dispositivo microfluídico é posicionar os canais de PDMS e a lamínula acima dos eletrodos da PCB.

Inicie colocando aproximadamente 10 microlitros de óleo mineral sobre a PCB. Para garantir um contato firme entre a PCB e a lamínula, posicione o conjunto do canal microfluídico com a lamínula sobre a PCB oleada com a lamínula voltada para cima. Ao entrar em contato com o óleo, pressione suavemente o conjunto microfluídico com a lamínula para assegurar um bom contato e minimizar bolhas de ar, que podem prejudicar a visualização de células e microesferas.

Outro passo importante é preparar a mistura de meio de baixa condutividade, 8,5% de sacarose e 0,3% de glicose peso por volume em água desionizada. O dispositivo microfluídico está agora pronto para uso; com uma pipeta, preencha cada canal microfluídico com 15 a 20 microlitros do meio de baixa condutividade, se necessário. Utilize aspiração a vácuo para remover quaisquer bolhas nos canais.

O próximo passo é introduzir as partículas de teste no dispositivo microfluídico. Esta demonstração utiliza uma suspensão de 550 microesferas de poliestireno por microlitro de meio de baixa condutividade, pois as microesferas podem sedimentar com o tempo; portanto, suspenda as microesferas com agitação. Em seguida, utilizando uma pipeta, introduza 200 microlitros da suspensão de microesferas de poliestireno no canal.

O próximo passo é preparar os eletrodos, conectando a saída de um gerador de funções à entrada de um amplificador de potência CA. Em seguida, conecte a saída do amplificador aos fios dos eletrodos. Cubra todos os fios elétricos e superfícies do equipamento com fita isolante para proteger os usuários da exposição potencial a choques elétricos.

Configure o gerador de funções para produzir uma onda senoidal de saída de um a 1,5 megahertz. Inicie a DEP para começar a separar as células e as microesferas nesta configuração. O canal de entrada está à direita e os três canais-alvo se separam no ponto de trifurcação.

Os eletrodos de PCB correspondem às faixas pretas sem fluxo laminar e sem DEP. As microesferas são essencialmente estacionárias após o início da DEP, mas sem fluxo. As microesferas migram em direção aos eletrodos de PCB e para longe do espaço entre os eletrodos quando o fluxo laminar está ativado.

Mas com o DEP desativado, as microesferas que fluem através dos canais de entrada são divididas entre os três canais-alvo. Quando o DEP é iniciado e o fluxo laminar está ativo, as microesferas são direcionadas para fluir apenas no canal central. Nos próximos vídeos, o dispositivo microfluídico foi girado acima dos eletrodos da PCB, resultando em uma mudança na orientação dos canais.

Em relação aos eletrodos de PCB. O canal de entrada, que anteriormente era perpendicular aos eletrodos do PCB, agora está quase paralelo aos eletrodos com o fluxo laminar ativado. Porém, com o DEP desativado, as microesferas entram igualmente nos três canais-alvo.

Quando o DEP é iniciado, as microesferas se aproximam do ponto de trifurcação e a força de DEP puxa as microesferas para o canal lateral acima do eletrodo. Este próximo conjunto de figuras no vídeo mostra uma mistura de células de adenocarcinoma de cólon humano ou células HT 29 e microesferas fluorescentes no dispositivo microfluídico. Nesta imagem de contraste de interferência diferencial (DIC), a seta aberta indica a direção do fluxo laminar, e os canais são delimitados por linhas tracejadas.

Os eletrodos metálicos refletivos podem ser vistos como a faixa clara de fundo; a microscopia de contraste de interferência diferencial é utilizada para imagens das microesferas durante a luminescência. Intensidade da escala. As imagens são usadas para tornar as células mais visíveis.

Esta figura é a mesma imagem da outra figura, exceto por ser exibida como uma imagem de intensidade em escala de brilho, para que seja possível visualizar tanto as células quanto as microesferas. Os eletrodos metálicos reflexivos aparecem como faixas amarelas e verdes nesta figura. Com a DEP, as microesferas saem pelo canal direito, conforme mostrado na imagem DIC, enquanto as células HT29 saem pelos canais central e esquerdo, conforme mostrado na imagem em escala de brilho antes da ativação da DEP. Uma solução mista de células e microesferas flui a partir de um canal de entrada para os três canais-alvo separados.

Após induzir a DEP, as microesferas e as células são acionadas seletivamente em canais separados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como começar a implementar a eletroforese dialética para a manipulação de células e microesferas em dispositivos microfluídicos.