Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

O objetivo geral do método a seguir é imaginar o comportamento de células individuais de diferentes cepas de levedura sob as mesmas condições dinâmicas. Isso é alcançado pela fabricação de um dispositivo microfluídico de duas camadas, na qual a camada inferior conterá separadamente cada uma das diferentes cepas, e a camada superior proporcionará as condições de fluxo dinâmico em um segundo passo. Diferentes cepas de levedura são colocadas nos poços e o dispositivo é fechado, criando um único canal com múltiplas cepas separadas.

Em seguida, registramos as respostas celulares a alterações dinâmicas do meio. Ao controlar as taxas de fluxo nas duas entradas do Canal Y, os resultados demonstram diferentes cepas submetidas às mesmas condições dinâmicas e ausência de contaminação cruzada entre poços. Este dispositivo microfluídico apresenta diversas vantagens principais em comparação com outros sistemas existentes. Ele permite o registro de imagens de múltiplas cepas distintas sob as mesmas condições dinâmicas.

Além disso, é importante destacar que ele pode ser facilmente fabricado em qualquer laboratório, sem necessidade de equipamentos especiais. A origem deste método surgiu a partir de discussões sobre como acompanhar as respostas de diferentes isolados selvagens de levedura à passagem por inanição. Inicialmente, desenhe ou imprima o layout desejado dos microcanais em escala.

Em seguida, cubra uma lâmina de vidro com camadas de fita adesiva transparente. Para atingir a altura desejada do canal, coloque o desenho do layout sobre uma superfície plana e alinhe a lâmina sobre o padrão do desenho. Agora, corte cuidadosamente a fita na lâmina de vidro de acordo com o layout. Remova a fita adesiva transparente de todas as regiões da lâmina de vidro.

Posicione aqueles no arranjo do microcanal. Coloque a lâmina em uma estufa aquecida a 65 graus Celsius por três minutos. Em seguida, limpe suavemente com etanol.

Misture os componentes base e de cura do PDMS conforme recomendado pelo fabricante. Despeje cerca de 30 mililitros da mistura de PDMS em uma placa de Petri até uma altura de aproximadamente 0,5 centímetro. Desgaseifique o PDMS sob vácuo, se necessário.

Submerja a lâmina de vidro no PDMS com a fita adesiva gravada voltada para cima. Colocar o padrão após o PDMS evita a formação de bolhas de ar entre a lâmina e o fundo do recipiente. Cure por 48 horas a 65 graus Celsius, certificando-se de que o recipiente esteja na posição horizontal usando um nível de bolha em um novo recipiente de Petri de 90 milímetros. Despeje três mililitros da mistura de PDMS.

Esta etapa pode ser realizada em um spin coder, se disponível. DGAs e cura conforme mostrado anteriormente. Agora, corte cuidadosamente a camada de fluxo do dispositivo microfluídico no tamanho desejado com um furador de biópsia.

Crie orifícios para as entradas e saídas na camada de fluxo. Corte também uma camada de poços de tamanho semelhante do segundo recipiente de Petri e coloque-a sobre um vidro grosso. Deslize sobre o layout do design.

Em seguida, perfure os poços alinhados aos microcanais no layout utilizando etanol, limpe ambas as camadas de PDMS e uma lamínula de vidro e deixe secar ao ar. A seguir, trate a lamínula de vidro e a camada de poços de PDMS com um gravador de plasma padrão para ligação não reversível ou com um tratador de corona portátil para ligação reversível. Coloque cuidadosamente a camada de poços sobre a lamínula para promover a adesão.

Removendo suavemente quaisquer bolhas de ar. Prepare o meio desejado em seringas apropriadas e conecte à tubulação tigon passada por uma bomba de seringa. Para imagem celular.

Utilize as concentrações. Vá para a fase desejada, vorte o cultivo completamente e transfira 300 microlitros para tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente um microlitro de con canna A em cada poço da camada de poços de PDMS.

Lave o excesso de conna A de cada poço duas vezes, pipetando água suavemente enquanto o con em A estiver secando. Lave as cepas duas vezes com 300 microlitros de meio SC sem glicose. A remoção da glicose residual das paredes celulares ajuda na aderência adequada ao conval.

Após a vorticização, pipete cuidadosamente aproximadamente 0,5 microlitros da suspensão celular em poços individuais. Lave suavemente as células residuais com meio rico. Os próximos dois passos precisam ser realizados rapidamente para evitar que as células sequem.

Como um passo opcional, trate o chip e os poços, tomando cuidado para não atingir diretamente os poços. Em seguida, sob um estereoscópio, coloque cuidadosamente o chip sobre os poços, prestando muita atenção no alinhamento entre os dois. Pressione suavemente para aderir as duas camadas de PDMS.

Encha lentamente o dispositivo completamente com cerca de 50 microlitros de meio rico, certificando-se de que não fiquem bolhas de ar dentro do canal. Agora, conecte o dispositivo inserindo os tubos nas entradas apropriadas e inicie o fluxo do meio. Tenha cuidado para que não se formem bolhas de ar nos tubos, pois elas podem ficar presas no dispositivo e interromper o fluxo.

Prossiga colocando o dispositivo sob um microscópio e localize pontos apropriados para imagem em cada um. Mantenha as células sob fluxo rico e médio por uma hora ou mais, se necessário, para permitir a recuperação.

Inicie o experimento com a configuração de fluxo constante. A bomba A para 0,8 mililitros por hora e a bomba B para 0,2 mililitros por hora. Para o meio A fluindo por 80% da largura do canal.

Podemos alterar dinamicamente as condições no dispositivo modificando as taxas de fluxo relativas. As novas condições se estabilizam em segundos ao longo de todo o canal. Para demonstrar a separação entre diferentes cepas, duas cepas distintas de levedura são visualizadas em poços alternados.

Observe que não há vazamento celular entre os poços neste experimento. Ambas as linhagens possuem o fator de transcrição MSN dois marcado com YFP para testar o efeito simultâneo de condições dinamicamente variáveis. As taxas de fluxo nos dois canais de entrada foram alteradas para criar um degrau de meio sem glicose.

Isso resultou na localização da MSN dois no núcleo. Importante, a análise do rastreamento temporal dos níveis de MSN dois YFP no núcleo em células individuais pode ser realizada. Assim, o dispositivo microfluídico de PDMS pode ser usado para aplicação de condições dinâmicas simultâneas em múltiplas poças.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não deixar as células secarem durante a montagem do dispositivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada facilmente sem necessidade de litografia macia.