Isolamento Islet murino de pâncreas
22 de agosto de 2007
Olá, sou Greg Zott. Trabalho no Centro de Diabetes da UCSF, no Laboratório Bluestone, e hoje vou mostrar o processo de isolamento de ilhotas pancreáticas de camundongos. O procedimento envolve a injeção de uma solução de colagenase no pâncreas de um camundongo doador C3H, seguida pela remoção desse pâncreas, digestão do tecido, purificação das ilhotas em um gradiente de Ficoll, seleção manual das ilhotas e, por fim, transplante na cápsula renal de um camundongo NOD diabético, que será o receptor.
Antes de iniciar este procedimento, diluímos nossa solução de ATE em um tampão Hanks modificado e ajustamos a concentração específica para a linhagem de camundongo que estamos utilizando, a C3H. Verificamos que a digestão é melhor com uma solução de colagenase a 0,8 mg por mL, e utilizaremos essa solução para injetar no ducto biliar comum a fim de distender o pâncreas. Realizando o procedimento hoje estará Pavo Codre do centro de diabetes. Ele fará a injeção, abrirá o camundongo, exporá os intestinos e, em seguida, injetará no ducto biliar comum.
Vamos pulverizar o rato com etanol para manter os pelos achatados e, em seguida, também verificaremos se o rato foi sacrificado corretamente com um aperto no dedo da pata. Pavo agora abrirá o rato e exporá o intestino e o pâncreas com uma incisão mediana. O diafragma também será cortado para verificar se o rato foi sacrificado.
Antes de começarmos, gostaria de destacar algumas das estruturas importantes. O estômago está localizado bem aqui, com o pâncreas aderido abaixo dele, indo até o duodeno e acima. Este é o fígado, onde encontraremos a vesícula biliar e o ducto biliar comum, que você pode ver bem aqui.
O que Pavo fará em seguida é isolar o intestino delgado e localizar onde o ducto biliar comum entra no intestino delgado. Uma vez exposto o intestino, aplicamos grampos do tipo mosquito em ambos os lados do ducto biliar comum. Verificamos que isso permite que mais colagenases entrem no pâncreas, enquanto outros grupos tentam posicionar o grampo diretamente sobre o ducto biliar comum.
Verificamos que esta é uma técnica melhor para permitir que a enzima entre no pâncreas. Este é um procedimento suave. Você não deseja romper o intestino.
Você deve permitir que as pinças fiquem suavemente em ambos os lados do ducto biliar comum. Agora, localizaremos uma vesícula biliar e, uma vez exposta a vesícula biliar, usaremos essa estrutura como guia para injetar a colagenase no ducto biliar comum. Powell está usando uma agulha de 30 graus com uma seringa de cinco cc contendo três mililitros de solução de colagenase.
À medida que ele entra no ducto biliar comum, ele dilata esse ducto com a solução de colagenase e, em seguida, desce pelo ducto biliar comum até se aproximar do intestino. E enquanto desce, a solução enzimática é bombeada e injetada no pâncreas. Agora que o pâncreas está inflado com a solução de colagenase, Powell vai remover os hemostatos e, então, remover o pâncreas do camundongo, separando-o cuidadosamente do intestino.
Ele o remove do estômago. Ok, e então, usando o baço como alça, levanta o pâncreas e, lentamente, o secciona no ducto biliar comum, e é isso. O pâncreas é exposto e, em seguida, o baço é removido; ali ele está removendo o tecido mesentérico, e então o pâncreas é colocado em uma solução de colagenase 2 miligrama por mililitro em um frasco de vidro esterilizado e devolvido ao gelo.
O pâncreas isolado que colocamos nos frascos de vidro será agora colocado em um banho-maria a 37 graus por aproximadamente 17 minutos. Colocamos os frascos em um suporte cônico de 50 mL para que não flutuem. Assim que o banho for iniciado, o cronômetro é acionado e a digestão começa.
Após o tempo de digestão ser concluído, os frascos são removidos e, em seguida, agitados e disruptados suavemente. E quando o tecido começa a se desintegrar, o frasco é colocado sobre gelo. Uma tela estéril é colocada sobre um béquer de 400 mil que contém tampão de lavagem.
O digesto de pâncreas é então cuidadosamente despejado sobre a peneira no tampão de lavagem. Para fins de demonstração, a cabine de segurança foi desligada e o vidro da cabine foi levantado para que pudéssemos ver o que estávamos fazendo. Uma vez que o digesto de pâncreas é despejado no béquer, os frascos são enxaguados com o mesmo tampão de lavagem e o tampão de lavagem é colocado sobre a peneira.
Temos uma seringa cheia com tampão de lavagem. Utilizaremos isso para lavar com força o tecido através da peneira. A ideia é liberar quaisquer olhinhos soltos que não estejam presos à matriz, mas deixando as membranas e o tecido não digerido sobre a peneira.
E quando você terminar de lavar um tecido, é isso o que geralmente se vê no final do procedimento. O tecido pancreático que está no fundo do tubo será agora transferido para dois cônicos de 50 ml, o tecido será lavado, misturado uniformemente e então distribuído de forma homogênea para que tenhamos um volume de pellet igual em cada tubo. O béquer é agora enxaguado com mais tampão de lavagem.
As laterais são enxaguadas para recuperar todo o tecido que entrou no béquer novamente. Em seguida, o material é distribuído igualmente entre os dois tubos, ambos de 50 ml. Os tubos cónicos são então completados com tampão de lavagem.
O tecido é invertido várias vezes e, em seguida, colocado em uma centrífuga. É uma centrifugação rápida. Permite-se que a centrífuga atinja mil RPM e, então, é desligada.
O tecido neste momento é muito sensível; os olhinhos são muito delicados, e você não deve comprimi-los em excesso. Os tubos são removidos e realizaremos este passo de lavagem mais três vezes. Este é o fim da terceira lavagem.
Os componentes do tubo cônico de 50 ml são transferidos para o tubo cônico de 15 ml e centrifugados a mil RPM, em seguida interrompidos. O sobrenadante será removido e a primeira parte do FI Call será iniciada. Estamos na etapa em que temos nosso digesto de pâncreas pelotado.
Vamos ressuspender esse tecido para que fique bem solto em relação aos pellets. Vamos adicionar o primeiro gradiente de densidade, que é 1 1 0 8. Vamos adicionar cinco mililitros a cada tubo.
O pellet é então misturado completamente em cada um dos gradientes. É importante que você obtenha uma boa distribuição do tecido no seu gradiente mais denso. Agora vamos sobrepor dois mililitros de densidade 1 0 9 6.
Em seguida, adicionaremos por cima duas camadas de densidade 1 0 6 9 e, sobre essa, a densidade 1 0 3 7. É importante que, durante a sobreposição das densidades, você não as misture. Então, todas as camadas terão sido adicionadas ao tubo.
E você pode ver que este é o topo de 1 1 0 8, o topo de 9 1 0 9 6, o topo de 1 0 6 9 e o topo de 1 0 3 7. E você pode observar que o tecido já está começando a migrar para sua densidade adequada, mesmo sem a centrifugação. Os gradientes de fial são levados à velocidade de 1800 RPM por 15 minutos, e lembre-se de manter o freio desligado após a remoção dos tubos da centrífuga.
É possível observar entre a camada 0 0 9 6 e a camada 0 0 7 uma boa faixa de tecido de ilhotas de Pablo. Agora, removendo a camada 0 3 7 para eliminar qualquer detrito tecidual e DNA que possa ter sido liberado durante o processamento. Utilizando uma pipeta Pasteur plástica estéril, ele agora removerá a camada de ilhotas e as transferirá para um tubo cônico de 50 ml contendo 25 ml de tampão de lavagem.
Você deseja fazer este passo rapidamente porque o fol é tóxico para os olhinhos. Na verdade, removemos toda a camada 0 6 9 e 0 9 6. Pavo corta a parte superior da pipeta de plástico e a enxágua com tampão de lavagem.
Os orifícios são então centrifugados da mesma forma que centrifugamos anteriormente. A centrifugação é realizada a mil RPM, depois paramos e aspiramos. Os orifícios do sobrenadante serão lavados três vezes com meio de lavagem.
Então, acabamos de concluir o processo de isolamento das pálpebras: partimos da digestão até o gradiente de fol, chegando aos clios purificados após a terceira lavagem com tampão de lavagem. Resuspendemos os clios no meio RPMI e os colocamos em uma placa de cultura de tecidos. Esses clios agora estão prontos para ensaios in vitro ou preparações in vivo, como o transplante de clios.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra o processo de isolamento de ilhotas de camundongo a partir do pâncreas de um camundongo doador C3H. O procedimento inclui injeção de colagenase, remoção do pâncreas e purificação de ilhotas para transplante em um camundongo NOD diabético.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Endocrinologia
- Biologia do Transplante
Antecedentes
- O transplante de ilhotas é um tratamento potencial para o diabetes.
- O isolamento de ilhotas requer digestão enzimática específica.
- A colagenase é comumente usada para o isolamento de ilhotas.
- Modelos de camundongo são frequentemente utilizados na pesquisa sobre diabetes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para o isolamento de ilhotas de camundongo.
- Preparar ilhotas para transplante em receptores diabéticos.
- Aprimorar a compreensão da função e viabilidade das ilhotas após o isolamento.
Métodos Utilizados
- Injeção de solução de colagenase no pâncreas.
- Remoção e digestão do pâncreas.
- Purificação de ilhotas pancreáticas usando um gradiente de Ficoll.
- Seleção manual de ilhotas pancreáticas para transplante.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de ilhotas a partir do pâncreas.
- As ilhotas preparadas para transplante mostraram viabilidade.
- O método demonstrou eficácia para estudos futuros.
- Potencial para melhorar o tratamento do diabetes por meio de transplante.
Conclusões
- O método descrito é eficiente para o isolamento de ilhotas de camundongo.
- O transplante de ilhotas pode ser uma opção viável para modelos diabéticos.
- Pesquisas futuras podem se basear nesta técnica de isolamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de ilhotas pancreáticas funcionais de modelos murinos permite a avaliação pré-clínica de terapêuticas para o diabetes e estratégias regenerativas. Esta técnica apoia a validação de alvos em doenças metabólicas, fornecendo um sistema relevante à doença para avaliar a secreção de insulina, viabilidade de enxertos e intervenções imunomoduladoras. Um rendimento confiável de ilhotas aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos promissores e na redução de riscos pré-clínicos para abordagens baseadas em transplante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas na homeostase da glicose e na função das células beta utilizando ilhotas murinas primárias.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte padronizada de tecido primário para estudos de engajamento de alvos e modulação de vias metabólicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece ilhotas purificadas adequadas para ensaios funcionais que medem a secreção de insulina e a viabilidade celular.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da preparação consistente de tecidos e purificação em gradiente de densidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a avaliação da eficácia do transplante de ilhotas em modelos de camundongos NOD diabéticos.
- Valor Operacional: Permite a continuidade dos estudos desde o isolamento até o enxerto, apoiando a validação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer tecido primário validado para a validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e estudos pré-clínicos de transplante na pesquisa sobre diabetes.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a função das ilhotas, sua sobrevivência e resposta a imunomoduladores ou compostos regenerativos.
- Triagem: Permite o preparo reprodutível de ilhotas para leituras funcionais de alta fidelidade em cascatas de triagem de compostos.
- Análises: Gera resultados quantitativos, como liberação de insulina e métricas de viabilidade, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento à validação pré-clínica por meio do transplante em receptores diabéticos, avaliando a função do enxerto e a tolerância imunológica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para gerar ilhotas relevantes para doenças em diversos programas terapêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio de tecido primário relevante para a doença.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização no isolamento de ilhotas por meio da digestão com colagenase e purificação em gradiente de Ficoll.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir a incerteza biológica em modelos pré-clínicos de diabetes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de estratégias de transplante e regeneração com base na função de ilhotas validada.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia de camundongos e manipulação de tecidos para isolamento e digestão do pâncreas.
- Depende da preparação da solução de colagenase e da otimização da concentração para linhagens específicas de camundongos.
- Requer acesso a equipamentos de centrifugação para etapas de separação por gradiente de densidade e lavagem.
- Envolve considerações de adaptação para variações específicas da linhagem no tamanho do pâncreas e na eficiência da digestão.
- É limitado pela sensibilidade do tecido durante o processamento, exigindo manipulação cuidadosa para preservar a viabilidade e a função das ilhotas.
