Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra
7 de setembro de 2012
Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.
O objetivo geral deste procedimento é isolar com sucesso os ilhotas do pâncreas de um camundongo. Isso é realizado primeiramente isolando o pâncreas do tecido circundante. Em seguida, o ducto biliar é canulado para que o pâncreas possa ser inflado com a mistura de colagenase protease.
Uma vez inflado, o pâncreas é removido e os ilhotas são cuidadosamente dissociadas. Por fim, as ilhotas isoladas são filtradas e semeadas para uso futuro. Em última análise, este método de isolamento de ilhotas com colagenase purificada e protease neutra é utilizado para obter o máximo rendimento de ilhotas e morfologia ideal das ilhotas.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de isolamento de ilhotes é que eliminamos a variabilidade entre lotes ao usar enzimas purificadas. Além disso, modificamos ou aprimoramos alguns protocolos para melhorar a morfologia dos ilhotes. Após a eutanásia, cubra o tronco com etanol 70% antes de abrir completamente a cavidade abdominal do ânus até o diafragma.
Em seguida, posicione o camundongo sobre a plataforma de um microscópio estereoscópico. Puxe o ceco e o cólon ascendente e coloque-os fora da cavidade corporal, à esquerda, deslocando os lobos do fígado contra o diafragma. Se eles não permanecerem nessa posição por conta própria, aumente a abertura da cavidade corporal.
Segure o duodeno com pinças curvas e localize o feixe da artéria hepática, veia porta e ducto biliar que se dirige ao fígado. Com outro par de pinças curvas, insira uma sutura sob o feixe de artéria, veia e ducto e aperte-a o mais próximo possível do fígado.
Usando dois pares de pinças curvas, segure cuidadosamente o duodeno e localize o ducto biliar ligado à papila. Na papila, use uma das pontas da pinça para perfurar através do pâncreas e do tecido conjuntivo logo abaixo do ducto biliar e próximo à papila. Rapidamente, passe a pinça através do orifício e insira uma sutura, deixando-a frouxa. Amarre a sutura ao redor do ducto biliar para formar um pequeno círculo, utilizando pinças de 90 graus.
Puxe o intestino delgado até que o ducto biliar fique tenso. Faça um corte horizontal através da papila com uma tesoura muito fina, sem desalojar o ducto biliar da papila, enquanto segura o intestino. Insira uma cânula no ducto biliar e, em seguida, puxe suavemente o fio cirúrgico ao redor da cânula.
Em seguida, preencha uma seringa de três mililitros com 2,0 mililitros da mistura de colagenase e protease. Injete essa mistura na cânula a uma velocidade lenta e constante. Após a inflação do pâncreas ser concluída, remova a cânula do ducto biliar.
A partir do cólon descendente, corte o tecido conjuntivo enquanto puxa os intestinos para cima até alcançar o ducto biliar. Em seguida, separe o pâncreas do baço e dos tecidos circundantes. Por fim, corte os pontos e remova o pâncreas.
Uma vez removido, coloque o pâncreas em um tubo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de HBSS sobre gelo. Após coletar todas as amostras, coloque os tubos de 50 mililitros contendo tecido pancreático em banho-maria a 37 graus Celsius. Durante 15 minutos, agite suavemente o tubo e verifique a dissociação do tecido.
Certifique-se de que o tecido se separe facilmente segurando o tubo pela tampa. Agite suavemente 12 vezes para dissociar ainda mais o tecido. Adicione não mais que 30 mililitros de HBSS e centrifugue.
Aspire cuidadosamente o sobrenadante e deixe uma pequena quantidade de sobrenadante no fundo para não perturbar a paleta celular. Usando uma seringa de 30 mililitros acoplada a uma agulha de calibre 14, adicione não mais do que 10 mililitros de HBSS e aspire a suspensão para cima e para baixo duas vezes. Filtre a mistura celular através de um funil plástico em T para um tubo de 50 mililitros.
Lave com mais 10 mililitros de HBSS e centrifugue. Decante o sobrenadante e inverta os tubos para drenar sobre papel toalha absorvente durante um minuto. Re-suspenda cada tubo em 10 mililitros.
Frio 1100. Sua sobreposição opaca, a sua opaca com 10 mililitros, HBSS e centrifugue. Remova completamente os 20 mililitros de sobrenadante utilizando uma pipeta larga de 25 mililitros e passe o sobrenadante através de um filtro invertido de 70 mícrons.
Filtre os organoides diretamente em uma placa de Petri e lave pipetando 10 mililitros de meio para organoides através do cultivo em filtro. Mantenha os organoides em um incubador de cultura de tecidos até o momento do experimento. Rendimento dos organoides, morfologia e qualidade são os parâmetros gerais utilizados para avaliar o sucesso do isolamento de organoides.
A morfologia típica dos orifícios é mostrada aqui. Os orifícios têm formato arredondado a oblongo com tamanho relativamente uniforme. Aqui. Orifícios isolados foram analisados quanto à secreção de insulina estimulada por glicose.
A estimulação pela insulina foi semelhante entre os ilhotas preparados com Sigma Type 11 em comparação com ci zyme TM, MABP, indicando uma alta qualidade no preparo dos ilhotas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como canular o ducto biliar de um camundongo. Trabalhe com colagenase zyme e neutro proteases para isolar suas pálpebras para qualquer ensaio.
Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento detalhado para o isolamento de ilhotas do pâncreas de camundongo utilizando cânula ductal pancreática in situ e uma mistura de colagenase-protease. O método tem como objetivo melhorar o rendimento e a morfologia das ilhotas, ao mesmo tempo que minimiza a variabilidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Endocrinologia
Antecedentes
- As células das ilhotas são cruciais para a produção de insulina.
- Métodos tradicionais de isolamento podem levar a variabilidade nos resultados.
- O uso de enzimas purificadas pode melhorar a qualidade das ilhotas isoladas.
- Protocolos aprimorados podem resultar em melhor morfologia das ilhotas.
Objetivo do Estudo
- Isolar efetivamente ilhotas do pâncreas de camundongo.
- Reduzir a variabilidade entre diferentes lotes de preparações enzimáticas.
- Otimizar a morfologia das ilhotas para aplicações em pesquisa.
Métodos Utilizados
- Isolamento do pâncreas de camundongo a partir dos tecidos circundantes.
- Canulação do ducto biliar para infusão de enzima.
- Inflação do pâncreas com uma mistura de colagenase-protease.
- Filtração e plaqueamento de ilhotas isoladas para experimentação.
Resultados Principais
- Dissociação e isolamento bem-sucedidos de ilhotas pancreáticas.
- Morfologia aprimorada das ilhotas observada após o isolamento.
- Preparações de alta qualidade de ilhotas indicadas por testes de secreção de insulina.
- O método demonstrou variabilidade reduzida em comparação com técnicas tradicionais.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o isolamento de olhinhos de alta qualidade.
- O uso de enzimas purificadas aumenta a confiabilidade dos resultados.
- Essa técnica pode ser benéfica para diversos ensaios que envolvem olhinhos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de ilhotas pancreáticas primárias permite a avaliação fisiologicamente relevante da função das células beta, o que é essencial para a validação de alvos no diabetes e a redução de riscos mecanicistas. A variabilidade no desempenho de lotes de enzimas compromete a reprodutibilidade entre campanhas de descoberta, afetando a identificação de compostos promissores e a confiança preditiva. Este protocolo aborda a inconsistência entre lotes por meio de colagenase e protease neutra purificadas, possibilitando o preparo padronizado e escalonável de ilhotas para avaliação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de sinalização intracelular e respostas secretórias em ilhotas primárias, aprimorando a validação de hipóteses sobre alvos.
- Valor Operacional: Reduz o ruído biológico decorrente da variabilidade enzimática, aumentando a confiabilidade dos resultados sobre o engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece rendimento e morfologia consistentes de ilhotas para ensaios confiáveis de secreção de insulina estimulada por glicose.
- Valor Operacional: A composição padronizada da enzima favorece a reprodutibilidade do ensaio entre laboratórios e campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a biologia de células beta relevante para doenças em estudos pré-clínicos de eficácia e toxicidade.
- Valor Operacional: Facilita a comparabilidade entre linhagens quando as proporções enzimáticas são ajustadas conforme as características teciduais específicas de cada espécie.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e os testes de eficácia pré-clínica, onde a função de ilhotas pancreáticas primárias orienta decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação funcional de alvos utilizando respostas de ilhotas semelhantes às humanas e fisiologicamente relevantes.
- Triagem: Permite avaliação padronizada e quantitativa dos efeitos de compostos na secreção de insulina.
- Análise: Gera variáveis dependentes mensuráveis, como níveis de secreção de insulina e rendimento de ilhotas, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a modulação de alvos na fase de descoberta a desfechos pré-clínicos por meio da preservação da morfologia e função das ilhotas.
- Reutilização Corporativa: Lotes de enzimas purificadas permitem a reutilização de protocolos em diversos projetos, reduzindo a necessidade de reotimização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista nas respostas das células beta.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do isolamento de ilhotas em diferentes locais e estudos.
- Valor Estratégico: Decisões mais eficazes de prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas de diabetes.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados funcionais confiáveis derivados de ilhotas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de camundongos e cânulação do ducto pancreático.
- Depende do acesso a colagenase purificada (CIzyme MA) e protease neutra (CIzyme BP) com atividade caracterizada.
- Necessita padronização das proporções enzimáticas (por exemplo, 35:10 colagenase:protease) para desempenho consistente.
- Pode ser necessária adaptação para cepas diferentes de C57BL/6 ou modelos de ratos, com base na densidade do tecido e na acessibilidade enzimática.
- Limitação prática: os passos de dissecação e inflação manuais restringem a produtividade na ausência de automação.
