Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é apresentar a estudantes universitários de ciências a tecnologia de microarranjos, examinando as diferenças de expressão em leveduras submetidas a estresse oxidativo. Isso é realizado primeiramente isolando o RNA total de culturas de levedura tratadas com peróxido de hidrogênio e dos controles não tratados. O segundo passo do procedimento consiste em gerar e purificar cDNA a partir dessas amostras de RNA.

O DNAc é então utilizado para preparar cRNA marcado com biotina por meio de transcrição in vitro. O passo final do procedimento é a fragmentação dos cRNAs marcados com biotina para hibridização com os chips gênicos de levedura AFI metrics. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as diferenças de expressão nas duas amostras de levedura e, por meio de bioinformática, demonstrar o poder da análise por microarranjo para estudantes de graduação.

A equipe de Extensão da Rede de Genética de Vermont teve pela primeira vez a ideia deste método ao ser encarregada de disponibilizar a tecnologia de microrrevestimento para estudantes de ciências em todo o estado de Vermont, com o objetivo de aprimorar sua educação científica. Até o momento, este método foi implementado em múltiplos locais de oito faculdades de graduação em todo o estado. Assim, a principal vantagem do uso do microrrevestimento em módulos educacionais é que ele nos dá a capacidade de ensinar técnicas gerais de biologia molecular, utilizadas diariamente em laboratórios, a um grupo de indivíduos.

E também utilizamos isso para ensinar a estudantes, professores e nossos grupos. Temos, de fato, estudantes e professores trabalhando juntos no mesmo projeto. Eles aprendem certas técnicas que exigem bastante habilidade, como o manuseio de RNA, que não é uma tarefa fácil.

Eles aprendem como precipitar DNA utilizando reagentes de visualização. Eles realmente aplicam as técnicas que encontrarão nos estudos de pós-graduação ou nos laboratórios de biologia molecular do dia a dia. Embora este método seja adequado para obter informações sobre estresse oxidativo e leveduras, certamente pode ser aplicado a outros organismos modelo e a outros sistemas biológicos que você possa querer analisar.

Alterações na expressão gênica, sejam elas associadas a mudanças no desenvolvimento, toxinas ambientais, estados específicos de doenças ou, de fato, a muitos outros fatores. Para examinar as diferenças de expressão em leveduras submetidas a estresse oxidativo, o RNA total é primeiramente extraído de dois cultivos de levedura por lise enzimática. Um cultivo foi exposto ao estresse oxidativo por meio de um tratamento de uma hora com 0,5 milimolar de peróxido de hidrogênio em solução salina tamponada de Hank, enquanto o outro cultivo foi tratado apenas com HBSS como controle.

Inicie rotulando dois tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro com as informações de identificação apropriadas. Transfira 1,5 mililitro da cultura de levedura apropriada para cada tubo. Centrifugue os tubos a 5.000 Gs por dois minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, use uma pipeta microlitros para remover e descartar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o precipitado. Verifique se o precipitado é grande o suficiente antes de prosseguir com o procedimento. Se o precipitado for muito pequeno, adicione 1,5 mililitros de cultura no mesmo tubo contendo o precipitado e, em seguida, centrifugue para obter um precipitado maior.

Descarte o sobrenadante com uma pipeta microliter, removendo o máximo possível do líquido do pellet de levedura. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão SG e 30 microlitros de solução de liase ao pellet de levedura e vortexie para homogeneizar. Incube ambos os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente durante a incubação.

Agite suavemente cada tubo a cada 10 minutos para gerar plátas. Um dos passos mais críticos ao realizar o plaqueamento esférico de levedura é garantir que você realmente criou 100% de plástico esférico após o tratamento. Isso significa que nem todas as enzimas líticas são iguais.

Portanto, você precisa verificar se a boa enzima lítica está proporcionando um bom esferoplastamento, o que significa que você deve coletar essas amostras, colocá-las em uma lâmina de microscópio e examinar ao microscópio após adicionar SDS a 0,1% para garantir que haja formação de protoplastos. Para observar o esferoplastamento completo, pipete 10 microlitros da amostra de levedura sobre uma lâmina de microscópio enquanto examina a amostra ao microscópio com um microlitro de SDS a 0,1%, o que faz com que as células de levedura inchem e formem esferas ou esferoides perfeitos. É importante observar que as células em brotamento também formam esferoides em forma de S.

Se for observada placa esférica parcial, recomenda-se um tratamento prolongado com liase. Uma vez confirmada a placa esférica completa com 350 microlitros de tampão BRLT para cada tubo, adicione 250 microlitros de etanol a 100%. Certifique-se de que o tubo está bem fechado segurando a tampa fechada e vortexe vigorosamente por um minuto.

Este procedimento irá lisear as placas Sphero. Após isso, utilize colunas R e easy Z spin para coletar e purificar o RNA das duas culturas. Por fim, avalie a qualidade do RNA extraído utilizando gel de agarose pré-moldado a 1,2% para eletroforese, a fim de preparar cRNA marcado com biotina.

O RNA total extraído das células de levedura é inicialmente utilizado para sintetizar o CD NA por transcrição reversa. Após a geração do CD NA, prepare os tubos com gel de travamento de fase para uso na precipitação do CD NA; centrifugue os tubos com gel de travamento de fase em velocidade máxima por um minuto para garantir que o gel esteja na parte inferior do tubo. Não agite os tubos com gel por vortex para precipitar o CD NA; pipete 162 microlitros da camada inferior de uma mistura de fenol, cloreto de benzila, álcool isoamílico tamponada com tris em pH 8,0, ou mistura PCI, e adicione ao conteúdo de 162 microlitros do segundo filamento, no tubo de reação de síntese de CD NA; volumes iguais das misturas aquosa e orgânica são necessários nesta etapa.

Vortex por cinco segundos para misturar o conteúdo. Em seguida, use uma micropipeta para transferir toda a mistura de CD N-A-P-C-I para o tubo com gel de bloqueio de fase. Não vortex o tubo com gel de bloqueio de fase; centrifugue em velocidade máxima por dois minutos.

Em seguida, utilize uma micropipeta para transferir a camada superior do tubo com gel de bloqueio de fase para um novo tubo rotulado de 1,7 mililitro. Tente coletar o máximo possível dessa camada. Adicione ao tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro: 405 microlitros de etanol a 100%, 80 microlitros de acetato de amônio e um microlitro de pellet paint vortex.

Coloque brevemente o tubo na centrífuga com a dobradiça virada para fora e centrifugue em velocidade máxima por 20 minutos. Ao término da centrifugação, à temperatura ambiente, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar o pellet de CD NA. O pellet deve ser rosa devido à tinta marcadora e ter aproximadamente o tamanho de um grão de sal.

Na lateral do tubo, sob a dobradiça, coloque o pellet de DNA no gelo e prossiga imediatamente para a limpeza do pellet. Para iniciar o procedimento de limpeza do pellet de DNA, utilize uma micropipeta P1000 para remover cuidadosamente todo o sobrenadante do tubo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet.

Adicione sua amostra de 500 microlitros de etanol a 80% frio ao tubo. Tampe o tubo suavemente e inverta-o lentamente várias vezes. Observe atentamente o seu pellet para garantir que ele não se solte da parede do tubo.

Se o pellet se soltar, você pode fazê-lo voltar para o fundo do tubo colocando o tubo novamente no suporte e deixando o pellet sedimentar até o fundo ou centrifugando o tubo em velocidade máxima por 15 segundos. Em seguida, use uma micropipeta P1000 para remover cuidadosamente o etanol sem perturbar o pellet. Incline o tubo para permitir a remoção da maior quantidade possível de líquido.

Adicione uma nova porção de etanol a frio, a 80%, tampe o tubo e inverta-o lentamente várias vezes. Após remover todo o etanol possível utilizando uma micropipeta P1000, centrifugue o tubo em velocidade máxima durante cinco segundos.

Em seguida, utilize uma micropipeta P10 para remover os últimos microlitros de etanol sem perturbar o pellet. Coloque o tubo aberto em uma caixa de secagem por 10 a 20 minutos para evaporar o etanol remanescente. O pellet pode ser facilmente perdido quando seco, portanto, tenha cuidado para manipular o tubo suavemente e fechar a tampa.

Quando a secagem estiver concluída, visualize o pellet seco para confirmar sua presença no tubo. Por fim, reconstitua o pellet seco em 22 microlitros de água livre de RNA e coloque o tubo em gelo. Este cDNA é então utilizado para preparar cRNA marcado com biotina por transcrição in vitro usando o kit Enzo BioArray.

Após o CRNA marcado com biotina ter sido purificado e quantificado, ele é fragmentado para a preparação do alvo. Uma vez que o cDNA tenha sido gerado, utilizamos então a metodologia padrão de transcrição in vitro para gerar CRNA biotinilado. O CRNA precisa passar por fragmentação antes de poder ser aplicado no chip de micromatriz.

Para iniciar este procedimento, transfira uma quantidade equivalente a cinco microgramas de CRNA para um tubo PCR de 0,5 mililitro identificado. Adicione água livre de RNAses suficiente para atingir um volume total de 16 microlitros e, em seguida, adicione quatro microlitros de tampão de fragmentação 5x ao tubo. O volume total no tubo deve ser de 20 microlitros.

Vortex a tubo e centrifugue por 10 segundos. Em seguida, incube o tubo a 94 graus Celsius por 30 minutos. Em um termociclador, coloque o tubo sobre gelo após a incubação.

O RNac fragmentado e não fragmentado de cada amostra é então avaliado por eletroforese utilizando um gel AROS pré-moldado a 1,2%. Quando a corrida é concluída, o gel é visualizado em um transiluminador e uma imagem é adquirida. O produto final da síntese é hibridizado aos chips genéticos de levedura atric e aqui são apresentados resultados representativos da análise de microarray.

Esta primeira figura é um exemplo de uma imagem digitalizada de um chip genético de levedura atrics gerada pelo software operacional do chip genético atrics. Este é um gráfico de dispersão bidimensional de todos os transcritos genéticos, cerca de 6.700 genes, comparando dados de levedura controle e tratados. Cada ponto representa um único gene.

Genes coloridos em roxo indicam genes que são diferencialmente expressos, enquanto genes coloridos em vermelho não são. Neste exemplo, a maioria dos genes diferencialmente expressos são aqueles envolvidos no controle do ciclo celular, conforme indicado por suas descrições. Este fluxograma do banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada ilustra genes diferencialmente expressos em uma via biológica afetada.

Os genes indicados com uma estrela vermelha indicam os genes subexpressos na via mitótica. Por fim, são apresentados aqui resultados representativos de um gráfico de volcão gerado usando o software Geo Species Gene Sifter. As amostras controle e tratadas foram comparadas com um valor de P de corte de 0,05 e uma alteração de expressão de 1,5 vezes como valor de corte.

Escolhemos usar levedura porque as leveduras são fáceis de cultivar rapidamente, mas também percebemos que a parte mais crítica do trabalho com levedura é, na verdade, criar uma esferoplastia adequada. Uma das coisas que não queremos fazer na microarray é realizar uma digestão incompleta e, consequentemente, esferoplastar apenas células que estejam em fase G1 ou G2/M. E aí você realiza um experimento de microarray com leveduras que estão em uma determinada fase de replicação.

Outro ponto complicado que tentamos destacar neste exercício é que o pellet de DNA, do qual as pessoas falam todos os dias, nem sempre é fácil de obter. No nosso módulo, utilizamos tubos especializados e reagentes de visualização. Assim, conseguimos centrifugar o DNA e visualizar o pellet, o que facilita o processo tanto para alunos quanto para professores.

De modo que possa ser utilizado em todas as fases do trabalho com DNA e RNA após seu desenvolvimento. Este módulo realmente abriu caminho para que os docentes nas instituições de graduação explorem, possivelmente, outros organismos modelo ou outros regimes de tratamento que possam ser compatíveis com os currículos existentes ou, talvez, com seus próprios interesses de pesquisa. E para lhes dar um exemplo de algumas das modificações realizadas, houve um local que investigou os efeitos do tratamento com herbicida em levedura, outro que analisou o tratamento com LAMP IDE em levedura, enquanto outro local examinou as alterações no desenvolvimento em uma linhagem celular de mamífero na qual tinham particular interesse.

E, por último, outro estudo analisou o impacto de diferentes fontes de luz em arabidopsis ou plantas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um experimento de microrrevestimento com estudantes universitários, incluindo o isolamento de RNA total de levedura, a geração de CDNA e a fragmentação de CRNA marcado com biotina. Experiências práticas com tecnologias de alto nível como essa ajudam a reforçar e fortalecer a educação científica em nível universitário.