Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é investigar os perfis de expressão gênica subjacentes a diversas fenótipos ou vias metabólicas. Isso é realizado primeiramente isolando o mRNA de duas linhagens contrastantes de nematoides. O segundo passo do procedimento consiste em sintetizar CD NA contendo sequências de captura S SI três ou SFI e hibridizá-las a um microarranjo.

O terceiro passo do procedimento é hibridizar a matriz microarranjo com sequências antiligantes contendo S SI três e SCIFI fluoro quatro. O passo final do procedimento é escanear a matriz microarranjo e analisar os dados utilizando ferramentas bioinformáticas, como o software magic tool. Em última instância, os genes candidatos que mediam o fenômeno biológico sob investigação são identificados e podem ser validados e quantificados por técnicas alternativas, como a PCR em tempo real.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os nucleotídeos marcados não são visíveis ao usuário, tornando difícil sobrepor uma mistura homogênea de hibridização aos mais de 23.000 nucleotídeos impressos de forma exclusiva. Comece coletando RNA de nematoides saudáveis e sincronizados. Primeiro, eles são lavados e re-suspensos em tubos de 15 mililitros, e os pellets de vermes são re-suspensos em sete mililitros de cloreto de sódio 0,1 molar e sete mililitros de sacarose a 60% peso por volume, gelada.

Após uma incubação de 15 minutos no gelo, os vermes são novamente centrifugados para formar o pellet. Agora, os vermes livres de bactérias sobrenadam, são coletados, lavados em água livre de RNAses e centrifugados novamente. Novamente, o pellet limpo e fracamente compactado é transferido para um tubo de microcentrífuga e centrifugado na velocidade máxima por 30 segundos.

Aspirar e armazenar em 10 volumes de RNA later a quatro graus Celsius até o momento do uso. Para preparar amostras de RNA total, centrifugar os pellets preparados em velocidade máxima, descartar o sobrenadante e adicionar uma pitada de resina molecular de moagem ao pellet. Em seguida, congelar a mistura usando nitrogênio líquido com um pistilo.

Triture a suspensão congelada de vermes em um pó fino, adicionando nitrogênio líquido conforme necessário para manter o pó frio após a trituração. Coloque o extrato no gelo por cinco minutos. Após cinco minutos, misture o extrato com 700 microlitros de R-L-T-B-M-E e 472 microlitros de etanol a 100% no total.

O RNA agora pode ser isolado utilizando um kit comercialmente disponível, obtendo um volume final de 60 microlitros de RNA isolado por amostra biológica. Antes de prosseguir, remova possíveis contaminações por DNA genômico tratando com DNAS one, seguido pelo uso de um kit de purificação de RNA comercialmente disponível. Complete o procedimento do kit referindo-se a um volume de 60 microlitros.

Por fim, determine a concentração de RNA e avalie a integridade do RNA mediante tratamento com carga da amostra de glioxal, corante e análise em gel antes da hibridização em microarranjo. O RNA purificado por métodos convencionais é transcrito reversamente em DNA complementar, que é purificado a partir do molde degradado com um kit comercialmente disponível e ajustado para um volume de 60 microlitros. Inicie a hibridização em microarranjo bloqueando a elegância marinha. Lâminas de microarranjo com DNA de esperma de salmão sonicado. Após uma hora, mergulhe as lâminas bloqueadas em água destilada duplamente e centrifugue.

Seque as lâminas em tubos cónicos de 50 mililitros forrados com uma toalha de papel absorvente. Agora, prepare um tampão de hibridização à base de formamida 2x. Primeiro, aqueça-o a 55 graus Celsius durante 10 minutos para dissolver completamente seus cristais.

Em seguida, centrifugue por um minuto a 10.000 ×g. Depois, misture 25 microlitros de CD NA com 25 microlitros de tampão de hibridização e agite suavemente a mistura. Agora, realize uma centrifugação rápida da mistura e incube-a a 80 graus Celsius por 10 minutos.

Após a incubação, pipete cuidadosamente toda a amostra de cDNA sobre a lâmina de microarranjo sem tocar a lâmina. Para espalhar uniformemente a amostra sobre a lâmina de microarranjo, abaixe suavemente uma lamínula sobre a lâmina utilizando uma agulha de seringa; antes que a lamínula seja completamente abaixada, levante-a novamente e abaixe com a agulha, permitindo que a lamínula caia suavemente no lugar.

Essa técnica minimiza a formação de bolhas de ar. Agora, posicione a lâmina horizontalmente em um tubo cônico de 50 mililitros abaixo da lâmina com 50 microlitros de água bidestilada e deixe incubando durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Uma segunda hibridização é realizada brevemente após a lavagem da lâmina.

Várias vezes no SSC, o segundo tampão, que contém reagentes de captura sensíveis à luz e um reagente Antifa, é aplicado usando a mesma técnica, seguido por uma breve incubação, mais lavagens e secagem. A lâmina pode então ser escaneada. As imagens podem ser analisadas usando o software gratuito com a ferramenta aberta magic tool.

Resumidamente, na guia projeto, crie e salve um novo projeto na guia criar perfil de expressão, selecione carregar par de imagens e escolha o arquivo de imagem vermelha como vermelho e o arquivo de imagem verde como verde. Em seguida, selecione a guia criar perfil de expressão. Escolha carregar lista de genes para enviar um arquivo de lista de genes de C. elegans obtido do site do GCAT para endereçar e alinhar a imagem da microarranjo.

Selecione a guia perfil de expressão de construção e a opção criar grade de edição. Agora edite a grade. Configure a caixa de diálogo usando 48 para o número de grades, 22 linhas e 22 colunas para cada grade e escolhendo numerar os pontos da esquerda para a direita e de cima para baixo.

Aumente a porcentagem de alteração de contraste e aproxime a imagem da grade até que os pontos individuais sejam facilmente distinguíveis. Crie as grades selecionando o ponto superior esquerdo definido no painel esquerdo e, em seguida, clicando no centro do ponto superior esquerdo, seguido pelo ponto superior direito e pela linha inferior na grade um. Repita este procedimento de gradeamento para cada uma das 48 grades, prosseguindo da esquerda para a direita e de cima para baixo.

Em seguida, salve selecionando a guia arquivo e salve a grade atual como uma vez salva. Selecione a guia finalizada para eliminar quaisquer pontos não relacionados da análise. Abra a guia criar perfil de expressão e, na opção de endereçamento da grade, selecione sinalização de pontos.

Agora marque quaisquer manchas de estria ou fluorescência de fundo e salve selecionando salvar marcadores atuais. Como na guia arquivo, os arquivos marcados devem ser segmentados. Por fim, analise os genes induzidos ou reprimidos por um fator especificado selecionando explorar na guia expressão.

Na caixa de diálogo de exploração, defina os critérios de correspondência para os genes. O número de aumentos ou diminuições duplos na expressão. A intensidade é conhecida como x e o valor de X é o critério para a alteração da expressão.

X é inserido com valor máximo maior que X para genes induzidos e valor mínimo menor que x para genes reprimidos. Neste experimento, é realizado um controle de troca de corante: duas isolamentos independentes de RNA total de larvas em estágio três e estágio quatro são hibridizados como mutante verde versus selvagem vermelho, enquanto mutante vermelho versus selvagem verde, para confirmar as alterações na expressão gênica. Faça três isolamentos independentes de RNA total utilizando o mesmo procedimento, sintetize cDNA com um kit comercialmente disponível e, para cada amostra de cDNA, realize PCR em tempo real em triplicata, utilizando três genes de referência como controles. Para demonstração, os seguintes resultados examinam a expressão gênica induzida em VSM um.

Mutantes AK 1468 são uma linhagem de nematódeo caracterizada por sinapses aprimoradas; antes de realizar a análise por microarranjo, a qualidade do RNA extraído é verificada por eletroforese em gel. A presença de dois subunidades ribossômicas intactas antes e após o tratamento com RNase I é indicativa de uma boa amostra de RNA no microarranjo; o DNAc do tipo selvagem é marcado em vermelho e o DNAc do mutante VSM I é marcado em verde. Neste, um dos 48 grids analisados por microarranjo, cada quadrado pequeno representa um oligonucleotídeo impresso individualmente; em cada arranjo, cada oligonucleotídeo único é representado.

Uma vez que a análise de microarranjo de transcritos isolados de larvas na fase quatro mostra que os genes que codificam as proteínas maiores de espermatozoides ou MSP são induzidos em mutantes VSM um, a análise de microarranjo de larvas na fase três também revela alterações na expressão dentro da mesma família gênica no mutante. Testes. As previsões provenientes do microarranjo por meio de análise de PCR em tempo real revelam que um membro da família gênica M ms P, MS P 32, é induzido nos mutantes VSM um. Os dados representam a média de três réplicas de PCR em tempo real a partir da mesma coleta de RNA.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar ferramentas bioinformáticas para análise em todo o genoma, especialmente considerando que existem muitos programas bioinformáticos de código aberto disponíveis para a comunidade científica.