Passaging células-tronco neurais
22 de agosto de 2007
A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.
Olá, eu sou o Steve. Trabalho no laboratório da Dra. Flanagan no Departamento de Patologia da uc, Irvine. Hoje vou mostrar como dividir células precursoras neurais humanas.
Essa técnica envolve revestir um novo frasco com uma solução de fibronectina humana, destacar as células com tampão de dissociação celular, neutralizar o tampão de dissociação celular com uma solução de soro a 10%, centrifugar a suspensão celular e ressuspender as células em meio fresco, transferindo a suspensão celular para um novo frasco. Em nosso laboratório, cultivamos células precursoras neurais humanas trocando metade do meio a cada dois dias, e repassamos as células aproximadamente uma vez por semana, dividindo-as na proporção de um para dois. Quando repasso as células, posso contá-las se quiser utilizá-las em um experimento de imunoquímica, ou se pretender realizar uma transfeção com um efetor nuclear.
É importante usar um tampão de dissociação celular ao manipular células porque, primeiro, ele é não enzimático, ao contrário da tripsina, e é muito mais suave para as células. Olá, estamos na sala de cultura de tecidos agora, e antes de mostrar a vocês como é um frasco confluente de células precursoras humanas, primeiro vou preparar a cultura de tecidos. Primeiro, vou desligar a luz ultravioleta e ligar a luz ambiente e o fluxo de ar.
Em seguida, vou desinfetar a câmara com etanol 70%, borrifando um papel-toalha e limpando a câmara. É importante borrifar o papel-toalha com etanol 70% e não o interior da câmara diretamente, porque pulverizar a câmara com etanol 70% pode danificar o filtro HEPA, que é muito caro. Em seguida, vou borrifar todos os reagentes e instrumentos.
E finalmente, vou pulverizar as mangueiras de vácuo, e estaremos prontos. Vamos dar uma olhada nessas células. Essas células parecem estar cerca de 80% confluentes.
Essas são células precursoras neurais humanas isoladas de fetos humanos, e as cultivamos em frascos T 25. Dividimos as células aproximadamente uma vez por semana, na proporção de um para dois. Estou pronto para repicar minhas células agora.
E primeiramente vou pegar um novo frasco T 25 que revesti por quatro horas com fibronectina humana da BD biosciences. Então removi a solução de fibronectina. Vou lavar este frasco com BBS antes de transferir as células para o frasco.
E agora vou retirar as células do incubador a 37 graus. Aqui estão elas. Agora vou remover a solução de lavagem de PBS do novo frasco que foi revestido com fibronectina humana.
E vou adicionar dois mililitros de meio condicionado antigo ao novo frasco. Agora preciso lavar minhas células com PBS antes de destacá-las da superfície. Primeiro, vou remover o meio remanescente e adicionar cerca de dois mililitros de PBS imediatamente, sem deixar as células secarem.
Vou esperar cerca de dois minutos antes de remover o PBS e aplicar o tampão de dissociação celular para remover as células da superfície do frasco. Agora vou remover o PBS e, novamente, tentarei adicionar imediatamente o tampão de dissociação celular para que as células não sequem. Então, vou adicionar 1,5 mL do tampão de dissociação celular.
E diferentemente do PBS, vou adicioná-lo diretamente sobre as células e tentarei cobrir a maior superfície possível. Por isso, estou movendo o frasco de um lado para o outro enquanto adiciono lentamente este tampão sobre as células. Agora, vou esperar cerca de cinco minutos para que as células comecem a se desprender da superfície.
E vou deixar o frasco à temperatura ambiente na capela. Como é possível observar aqui, as células começam primeiro a se arredondar e, em seguida, começam a se soltar da superfície, e você já pode ver algumas células flutuando. E se você bater levemente no frasco na lateral, isso vai ajudar a soltá-las.
Então, já se passaram cinco minutos, e, como você pode ver, a solução ficou bem densa com células que se desprendeu da superfície. Agora vou neutralizar o efeito do tampão de dissociação celular adicionando 4,5 mL de meio contendo soro. Vou utilizar soro bovino fetal inativado pelo calor a 10% em meio D-M-E-M-F 12, e vou adicioná-lo diretamente sobre a superfície do frasco para garantir que não permaneçam células aderidas.
E vou, vou pipetar suavemente para cima e para baixo para desprender quaisquer células remanescentes. Em seguida, vou transferir a solução celular para um tubo cônico de 15 mL. E vou centrifugar a mil RPM por um minuto.
Então, as células terminaram a centrifugação e temos aqui um belo pellet celular. Vou remover o meio com soro com muita, muita cautela, sem tentar perturbar o pellet. Em seguida, vou ressuspender o pellet em quatro mililitros do meio.
Então, vou tentar ressuspender o pellet de modo que não haja grumos celulares remanescentes, para que a solução fique homogênea e não contenha grumos. E como estou realizando uma divisão de um para dois, vou pegar dois dos quatro mililitros e transferi-los para o novo frasco que já contém dois mililitros do meio condicionado. Por fim, vou rotular o frasco com o tipo celular, o número de passagem e a data.
Esta é uma observação das células que passamos há meia hora. Como é possível ver, a maioria delas já aderiu à superfície e começou a emitir prolongamentos. É tudo, pessoal.
E agora estou pronto para contar.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para o cultivo e repicagem de células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) in vitro. A técnica tem como objetivo aumentar a reprodutibilidade da pesquisa com células-tronco humanas e facilitar a investigação do desenvolvimento neural e de possíveis aplicações terapêuticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia de Células-Tronco
- Técnicas de Cultura Celular
Contexto
- As células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) são fundamentais para o estudo do desenvolvimento neural.
- A manipulação in vitro de hNSPCs pode levar a avanços terapêuticos.
- A reprodutibilidade na pesquisa com células-tronco é essencial para o progresso científico.
- As técnicas de cultivo celular são fundamentais na pesquisa em neurociência.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para o cultivo de hNSPCs.
- Facilitar o uso de hNSPCs em aplicações experimentais.
- Ampliar a compreensão do desenvolvimento neural humano.
Métodos Utilizados
- Revestimento de frascos com fibronectina humana.
- Utilização de tampão de dissociação celular para destacar as células.
- Neutralização do tampão de dissociação com uma solução de soro.
- Centrifugação e ressuspendimento das células em meio fresco.
Resultados Principais
- Passagem bem-sucedida de hNSPCs utilizando o método descrito.
- Melhoria na reprodutibilidade das práticas de cultura celular.
- Potencial de aplicação em experimentos de imunoquímica e transfeção.
- Estabelecimento de um rotina para trocas de meio e frequência de passagem.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem sistemática para o cultivo de hNSPCs.
- Melhorias na reprodutibilidade podem levar a melhores resultados experimentais.
- Pesquisas futuras podem explorar o potencial terapêutico dos hNSPCs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A passagem padronizada de células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) favorece modelos in vitro reprodutíveis para validação de alvos e desvio mecanicista em pesquisas sobre doenças neurodegenerativas. A expansão confiável de hNSPCs permite entradas consistentes em ensaios para triagem fenotípica e programas de identificação de compostos líderes. Este protocolo aborda a variabilidade no cultivo de células-tronco que pode comprometer estudos translacionais de biomarcadores e a fidelidade de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da modulação de vias neurais utilizando hNSPCs geneticamente estáveis que expressam nestina e SOX2.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade induzida pelo cultivo que obscurece leituras de engajamento do alvo na triagem inicial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece hNSPCs com morfologia aderente e bipolar adequadas para imagens de alta complexidade de crescimento de neuritos ou expressão de marcadores sinápticos.
- Valor Operacional: Divisão padronizada 1:2 a cada 7 dias sustenta densidades de semeadura escaláveis para ensaios em placas de múltiplos poços.
- Valor Estratégico: Frascos revestidos com fibronectina melhoram a eficiência de adesão, reduzindo a inconsistência entre poços em triagens de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a expressão de marcadores indiferenciados, preservando a multipotência para diferenciação em subtipos neuronais relevantes para doenças.
- Valor Operacional: O arraste de meio condicionado durante o repicagem sustenta estudos de fatores parácrinos relevantes para vias neuroinflamatórias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de repicagem insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização de ensaios e a geração de modelos pré-clínicos, onde a consistência de hNSPC influencia a confiabilidade dos dados em todas as etapas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da expansão controlada de hNSPCs para triagem com CRISPR ou estudos de superexpressão.
- Triagem: Permite densidades de plaqueamento reprodutíveis para quantificar os efeitos de compostos sobre a viabilidade celular ou marcadores de diferenciação.
- Análises: Gera suspensões homogêneas adequadas para citometria de fluxo ou imunocitoquímica, proporcionando leituras quantitativas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com trabalhos pré-clínicos ao fornecer uma fonte escalável para gerar neurônios ou gliócitos destinados a estudos de eficácia de transplantes.
- Reutilização Empresarial: O revestimento definido e a frequência de repicagem permitem a transferência de tecnologia entre diferentes locais para programas pluripartidários de células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva em ensaios derivados de células-tronco por meio da redução da deriva induzida por passagens.
- Valor Operacional: Etapas padronizadas de dissociação e neutralização melhoram a reprodutibilidade dia a dia.
- Valor Estratégico: Permite ampliação com eficiência de capital ao reduzir lotes falhados devido a subcultivos inconsistentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões ajustadas ao risco em portfólios de doenças neurodegenerativas ao melhorar a fidelidade dos dados nas cascatas de validação de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige treinamento em técnica asséptica para o manuseio seguro de tampões de dissociação e suplementos séricos.
- Depende do acesso a materiais de cultura revestidos com fibronectina humana e tubos cônicos estéreis para centrifugação.
- Necessita padronização do momento da passagem em relação à confluência (~80%) para evitar diferenciação induzida por supercrescimento.
- A adaptação a culturas em suspensão ou em forma de esferoides exigiria ajustes na matriz além do revestimento aderente com fibronectina.
- Limitado a operações em escala de pesquisa; a passagem compatível com boas práticas de fabricação exigiria biorreatores de sistema fechado e reagentes qualificados.
