Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir e identificar parceiros de DNA associados em longa distância. Isso é alcançado por meio da fixação, lise celular e digestão do DNA pela primeira enzima de restrição, seguida pela ligação para criar um DNA quimérico composto por segmentos dos dois genes associados. Em seguida, ligantes são adicionados ao DNA quimérico após a segunda digestão de restrição para facilitar sua amplificação. A amplificação por PCR é então realizada usando primers específicos para os ligantes e para o DNA isca, a fim de obter quantidades suficientes dos fragmentos de DNA associados. Os resultados obtidos mostram os parceiros de DNA associados em longa distância com o DNA isca, com base na análise de sequência dos fragmentos de DNA amplificados.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a captura de conformação de cromossomos ou o três C, é que o A-C-T-S-A pode ser usado para identificar efetivamente um parceiro de DNA associado em longo alcance desconhecido. Enquanto o três C surgiu para verificação apenas de interações previamente suspeitadas. Para iniciar este protocolo, cultive células humanas em um incubador suprido com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que atinjam 80 a 90% de confluência.

Células de leucemia promielocítica aguda humana são utilizadas para esta demonstração. Colete as células despejando-as em um tubo NOC de 50 mililitros e centrifugue a 1200 RPM por 15 minutos. Após a centrifugação, remova o meio por aspiração.

Adicione cinco mililitros de meio de cultura para ressuspender os pellets celulares. Após a contagem das células com um hemocitômetro, transfira aproximadamente um vezes 10 à sétima células para um volume de 40 mililitros com RPMI 1640, meio contendo 10% de FBS. Em seguida, adicione 1,7 mililitro de formaldeído a 37% para fixar a cromatina diluída.

Incube a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave. Após a incubação, interrompa a reação com 2,4 mililitros de glicina 2 molar. Em seguida, centrifugue a amostra por 15 minutos a 1200 RPM e 4 graus Celsius.

Após remover o sobrenadante, lave o pellet uma vez com 40 mililitros de PBS gelado, em seguida centrifugue a amostra para recuperar o pellet celular lavado. Ressuspenda o pellet resultante em 40 mililitros de tampão de lise gelado contendo inibidores de protease recém-adicionados e PMSF 0,1 milimolar. Incube a amostra em câmara fria com rotação durante 90 minutos. Por fim, centrifugue a amostra a 2.500 RPM por 15 minutos, remova o sobrenadante e obtenha os núcleos isolados. Ressuspenda os núcleos em 0,5 mililitros de tampão NEB 1X e adicione 15 microlitros de SDS 10%.

Incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora com agitação. Em seguida, adicione 45 microlitros de Triton X-100 a 20% para sequestrar o SDS e incube novamente a 37 graus Celsius por uma hora com agitação e alíquota de um vezes 10 à sexta. Os núcleos ou cerca de 15 microgramas são usados para digestão com enzima de restrição em 55 microlitros de solução de núcleos.

Adicione 433 microlitros de um tampão XNEB três e 12 microlitros de BGL dois. Para obter um volume total de reação de digestão de 500 litros, incube a reação a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, inative a enzima de restrição adicionando 95 microlitros de SDS a 10% e desnature a enzima aquecendo a 65 graus Celsius por 20 minutos.

Em um banho-maria, adicione sete mililitros de tampão de ligação 1x e 360 microlitros de Triton X-100 a 20%. Incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora. Reduza a temperatura para 16 graus Celsius e adicione 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.

T quatro DNA ligase. Incube a reação de ligação a 16 graus Celsius por quatro horas e, em seguida, à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a conclusão da ligação, adicione 300 microgramas de proteinase K e incube a 65 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, adicione cinco microgramas de RNAA e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Purifique o DNA por extração com fenol-clorofórmio e precipite o DNA em isopropanol; dissolva o DNA precipitado em 150 microlitros de água destilada estéril. Para adicionar ligantes ao DNA quimérico, primeiro digira o DNA incubando dois microgramas de DNA purificado com cinco unidades de msp um, a 37 graus Celsius por quatro a seis horas. Após a digestão, inative o MSP um a 65 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, precipite o DNA em etanol com um microlitro de cinco miligramas por mililitro. Glicogênio, dissolva o pellet de DNA resultante em 50 microlitros de água destilada estéril. Em seguida, misture 50 microlitros de DNA tratado com MSP1 com dois microlitros de um oligonucleotídeo ligante de 20 micromolar (L) e um microlitro de um oligonucleotídeo S de 20 micromolar; então adicione um microlitro de água destilada estéril e seis microlitros de tampão 10 XT4 DNA Ligase.

Cubra a mistura com cera líquida. Desnature os oligonucleotídeos a 50 graus Celsius por um minuto e deixe esfriar gradualmente até 10 graus Celsius em um gradiente de 0,5 graus Celsius por minuto. Usando um ciclador térmico, adicione um microlitro de ligase de DNA T4 a 400 unidades por microlitro e incube a reação a 15 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, purifique o DNA ligado ao ligante utilizando um kit de purificação rápida de PCR Kaya e elua em 50 microlitros de água destilada estéril. Em seguida, escolha um iniciador para a região específica de DNA a ser investigada quanto a interações de longo alcance. Neste exemplo, Abel será usado como o iniciador ou isca.

Prepare o DNA purificado para a primeira rodada de PCR combinando um microlitro do DNA purificado com um microlitro de um iniciador específico do oligonucleotídeo um com concentração de 20 micromolar, 46 56, e um microlitro de um iniciador específico do ligador com concentração de 20 micromolar, 29 63. Em seguida, adicione três microlitros de três x ClinTech, uma mistura de DNA polimerase previamente preparada com 32 P-D-C-T-P de acordo com o protocolo escrito, seguido por três microlitros de água destilada estéril. Realize a amplificação por PCR utilizando o ciclo térmico de PCR com início quente descrito no protocolo escrito após a conclusão do ciclo de PCR.

Limpe os produtos da primeira rodada de PCR utilizando um kit de purificação PCR rápido kaya. Eluir em 30 microlitros de água destilada estéril. Utilize um microlitro do produto da primeira PCR diluído 100 vezes para realizar uma segunda rodada de PCR usando primers aninhados, adicionando um microlitro de primer específico de 20 micromolar para o gene abel1, 46 26, e um microlitro de primer específico para o linker de 20 micromolar, 29 61.

Novamente, adicione três microlitros de três x ClinTech, DNA polimerase, um coquetel e três microlitros de água destilada estéril. Realize a segunda rodada de PCR utilizando um programa térmico de 25 ciclos de 95 graus Celsius por 20 segundos, 67 graus Celsius por 40 segundos e 72 graus Celsius por um minuto, seguido por uma etapa de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos.

Visualize os produtos da PCR realizando um gel de página com ureia a 5% e, em seguida, escaneie a tela exposta em um imageador de fósforo. Cada banda de PCR pode ser recuperada do gel dissolvendo as tiras de gel em um tubo eppendorf contendo 60 microlitros de água destilada estéril e incubando a 95 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue os produtos de gel dissolvidos brevemente a 10.000 RPM por 10 segundos.

Para coletar todas as amostras. Remova um microlitro para usar como modelo de DNA para realizar a PCR com o reparo do iniciador. 29 61 46 26.

Usando as mesmas condições descritas acima, após a purificação, a análise de sequenciamento pode ser realizada com uma ferramenta online para determinar a localização cromossômica. Uma vez no site de bioinformática genômica, clique em blatt para gerar uma nova janela e cole a sequência de DNA. Após o envio da sequência de DNA, os resultados da busca BLATT serão exibidos.

Clique no navegador no resultado com 100% de identidade para revelar a localização da sequência de DNA. A região do gene able foi usada como isca para determinar suas interações de DNA de longo alcance. Dois sítios BGL e um sítio BAM H foram escolhidos para o ensaio A CT na segunda rodada do conjunto de primers de PCR; o primer 46 26 29 61 foi usado para amplificar o alelo M1, o 46 30 29 61 foi usado para o alelo M2 e o 46 36 29 61 foi usado para o alelo M3.

Um padrão típico de gel revela uma a várias bandas, como mostrado aqui para o clone M1 capaz, M2 capaz e M3 capaz. A sequência de DNA do clone M1 capaz é mostrada para demonstrar que cada fragmento proveniente de um ensaio A CT consiste em dois segmentos de DNA combinados. Um segmento é derivado da região de DNA isca, enquanto o segundo segmento provém do parceiro associado.

Os segmentos são ligados uns aos outros pela primeira sequência de reconhecimento da enzima de restrição. A segunda sequência de reconhecimento da enzima aparecerá ao final da sequência parceira associada. O fragmento M1 clonável contém DNA da região do ABLE um localizada no cromossomo nove Q 32,4, e o parceiro associado está localizado no cromossomo três P três, que foi identificado como proc dois.

Da mesma forma, o parceiro associado ABLE M2 foi localizado no cromossomo 5q21.1, enquanto o clone ABLE M3 foi identificado como uma associação intracromossômica próxima ao locus ABLE1, em contraste com os ensaios 3C. A metodologia descrita neste vídeo selecionará as interações de longo alcance mais prevalentes. No entanto, aumentando o número de ciclos de PCR, é possível identificar também associações adicionais menos frequentes, utilizando a região de impressão e controle ou ICR no locus IGF2-H19 como DNA isca em células de fibroblastos de camundongo, aplicando diferentes programas de ciclagem na primeira e segunda rodada de PCR no ensaio A CT.

O ensaio A CT também pode ser utilizado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerosas. O tecido normal do cólon e o tecido de câncer de cólon foram homogeneizados e o ensaio A CT foi realizado seguindo os procedimentos descritos aqui. É mostrada aqui a estrutura do DNA da região ICR no locus IGF dois H 19 e do gene IGF dois dpn.

Dois sítios para o ensaio A CT são marcados; os iniciadores utilizados na PCR da segunda rodada são indicados por setas e números em diferentes cores. O padrão do gel no ensaio A CT representa os resultados da PCR utilizando o iniciador 29 61 com os pares de iniciadores 41, 61, 41 63, 51 45 e 51 51. As bandas únicas que aparecem apenas no tecido normal do cólon são indicadas por setas amarelas, e aquelas bandas que surgiram apenas no tecido de câncer de cólon são indicadas por setas vermelhas após seu desenvolvimento.

Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de biologia do mercado explorarem a arquitetura nuclear e a regulação gênica de maneira tridimensional.