Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated
28 de junho de 2012
Montagens genômicas baseadas em tecnologias de sequenciamento de DNA em massa paralela são geralmente altamente fragmentadas. O desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens genômicas. Aqui, demonstramos abordagens inovadoras para o preparo de cromossomos, hibridização fluorescente in situ e imageamento que aumentam significativamente o rendimento no desenvolvimento de mapas físicos.
O objetivo geral deste procedimento é mapear sondas de DNA em cromossomos politênicos de mosquito utilizando uma preparação cromossômica de alta pressão, seguida por hibridização fluorescente automatizada em C dois e imagem automatizada. Isso é realizado primeiramente preparando lâminas com espalhamento de cromossomos politênicos usando um método de alta pressão. A próxima etapa do procedimento é preparar sondas fluorescentes rotulando DNA genômico com o fluorocromo utilizando um protocolo de tradução Nick.
O terceiro passo é realizar a hibridização fluorescente in C dois usando sistemas automatizados de coloração de lâminas. O passo final é escanear e fotografar os cromossomos marcados utilizando um sistema automático de imagem fluorescente. Em última análise, as imagens podem mostrar a localização de uma sonda de DNA marcada com fluorescência no poli cromossomo.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como um protocolo-padrão manual de hibridização in situ, é que o protocolo de mapeamento físico de maior produtividade gera resultados mais consistentes e reduz drasticamente o tempo de manipulação. Este protocolo começa com a dissecção de fêmeas semigrávidas e oly cerca de 25 horas após a alimentação com sangue, para coletar seus ovários quando estiverem no estágio três de Christopher. Neste estágio, a área transparente com células de nutrição nos folículos deve ter formato arredondado; colete ovários de cinco fêmeas e fixe-os em 500 microlitros de solução modificada de carnoy recém-preparada.
Em seguida, eles podem ser armazenados à temperatura ambiente por até 24 horas ou por períodos mais longos a menos 20 graus Celsius. Em seguida, logo antes de preparar as lâminas de dissecação de ovário, prepare a solução de carnoisa e ácido propiônico a 50%. Coloque cada par de ovários em uma gota de solução de carnoisa fresca sobre uma lâmina livre de poeira sob um microscópio de dissecação.
Divida os ovários com a agulha de dissecação. Transfira todos os fragmentos ovarianos para seis lâminas limpas com ácido propiônico a 50%. Separe os folículos uns dos outros utilizando agulhas de dissecação.
Em seguida, remova quaisquer tecidos remanescentes com uma toalha de papel. Adicione outra gota de ácido propiônico a 50% e aguarde de três a cinco minutos. Diz a lenda que os folículos permanecem em ácido propiônico a 50% por três a cinco minutos, o que melhora significativamente a dispersão dos cromossomos.
Em seguida, aplique uma lamínula e aguarde mais um minuto para espalhar os núcleos. Envolva a lâmina com papel de filtro e plástico. Ajuste um Dremel entre três e 5.000 rpm e, durante cerca de um minuto, gire levemente a ponta do Dremel em movimento contra a lamínula.
Confirme a qualidade da espalhamento com um microscópio de contraste de fase e aplique o dremel por mais tempo, se necessário, para achatamento dos cromossomos. Coloque um segundo lamínula adjacente ao primeiro, depois empilhe as lamínulas com outro microscópio. Em seguida, envolva as lâminas com uma folha de plástico e com papel de filtro, coloque as lâminas envolvidas em um torno para comprimi-las entre 85 e 120 polegadas-libra.
Após achatamento dos cromossomos em todos os seis lâminas, desembrulhe os lâminas e remova os lâminas extras para achatamento adicional dos cromossomos. Incube os lâminas a 55 graus Celsius por 10 a 15 minutos em um sistema de desnaturação e hibridização de lâminas. Em seguida, mergulhe um lâmina em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos ou até que a borbulhagem cesse.
Em seguida, remova rapidamente a lamínula com uma lâmina de barbear e coloque imediatamente a lâmina em etanol a 50% frio por cinco minutos. Repita este processo para cada lâmina sequencialmente. Desidrate as lâminas em banhos de etanol a 70%, 90% e 100%.
Mergulhe-os em cada banho durante cinco minutos. Por fim, após as lâminas secarem ao ar, estarão prontas para a hibridização por fluorescência para coloração. Um dispositivo automatizado realiza a maioria das etapas do procedimento, exceto a marcação da sonda.
Antes de carregar o dispositivo, prepare a sonda fluorescente marcando novamente o DNA com o fluorocromo, utilizando um protocolo comercial de tradução NIC. Com a sonda preparada, carregue as lâminas e os reagentes no sistema automatizado de lâminas. Configure o sistema para realizar os seguintes passos. Primeiro, forneça 800 microlitros de 1x PBS por 20 minutos.
Segundo, seque os lâminas com secador. Terceiro, fixe os lâminas com 450 microlitros de formalina 4% em um XPBS por um minuto. Em seguida, lave os lâminas com etanol 100% por um segundo, duas vezes, e por dois minutos.
Após o banho de etanol, sopre os lâminas novamente. Agora aqueça os lâminas a 45 graus Celsius por dois minutos para evitar a formação de bolhas. Em seguida, aplique 20 microlitros da sonda de DNA, seguido por uma gota de óleo mineral e uma lamínula. Em seguida, desnature os cromossomos a 90 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, deixe as lâminas hibridizarem a 42 graus Celsius por 14 horas. Após a hibridização, realize as lavagens de restrição por dois minutos a 42 graus Celsius, seguidas por quatro aplicações consecutivas de um segundo de dois XSSC e secagem. Em seguida, aplique 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 graus Celsius por 10 minutos, duas vezes, seguido por mais uma lavagem e dois XSSC a 25 graus Celsius por 10 minutos.
Aplique agora a coloração: 50 microlitros de Yo-Yo-1, seguidos por óleo mineral e lamínulas. Incube as lâminas a 25 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, remova as lamínulas.
Lave as lâminas em duas XSSC quatro vezes, durante um segundo por lavagem, e seque-as com ar. Por fim, aplique 15 microlitros de reagente antidesvanecimento prolongado de ouro a cada lâmina e coloque lamínulas novas. Ligue o sistema automatizado de digitalização Accord plus, começando pela fonte de alimentação Olympus U-R-F-L-T para uma lâmpada de halogênio.
Em seguida, o computador e, por último, o microscópio com um acessório de câmera. Agora, abra primeiro o pacote de software duet, configure uma pré-visualização de 10x. Clique no botão online, insira um novo ID de caso e atribua um ID de lâmina.
Clique no ponto marcado como bf. Esta é a opção de campo claro. Selecione uma opção de digitalização para pré-digitalização de 10 x.
Selecione 2, 500 x círculo, 10 000 x círculo ou retângulo. Clique em definir e executar. Em seguida, ok, siga as instruções para ajustar corretamente a digitalização e depois clique em finalizar.
Para iniciar a varredura, pressione a guia principal para voltar à tela principal. Agora, clique no botão offline, localize o ID do caso e o ID da lâmina que foram atribuídos e clique em offline.
Realize a varredura na caixa preta na área superior esquerda. Clique em uma seta e selecione a pré-varredura 10 x. Use as setas para percorrer as imagens escaneadas após encontrar uma imagem de interesse.
Clique duas vezes na tela no centro da região selecionada e pressione capturar. Isso definirá uma imagem para captura posterior após a seleção de todos os alvos. Clique com o botão direito em cada imagem, clique em classificar, selecione pré-escaneamento de 10 x e selecione politano.
Retorne ao menu principal e configure a pré-varredura de 40 x. Selecione online novamente e escolha uma lâmina. Altere BF para ffl e mude o nome da tarefa para revisit dash X 40 dash rg.
Altere a seção logo abaixo da última configuração para revisitar todos os traços. Em seguida, execute o programa e siga as instruções. Para configurar a automação, clique no botão iniciar correspondência de visualizações para corresponder as imagens de 10 x e 40 x.
Clique em finalizar para iniciar a varredura. Após concluir, clique em classificar e examine as imagens. Preparações de cromossomos politênicos de células nodais ovarianas de fêmeas de Anopheles gambiae foram feitas utilizando a técnica de alta pressão.
Este método não danifica nem altera a maior parte da estrutura cromossômica. Ele aplaina os cromossomos dobrados e, assim, revela bandas finas ocultas que não são vistas em preparações convencionais. O cromossomo foi hibridizado com clones de DNA retroprojetados obtidos da biblioteca Tam back de S. Gambia.
A biblioteca foi gerada a partir de larvas estrela do primeiro estágio de machos e fêmeas da linhagem de praga Anopheles gambiae. Após este procedimento, pode-se realizar um mapeamento físico automatizado de alto rendimento, a fim de facilitar o desenvolvimento rápido de montagens genômicas baseadas em cromossomos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo de alto rendimento para mapear sondas de DNA em cromossomos politênicos de mosquito. Ao utilizar a preparação de cromossomos sob alta pressão e técnicas de imagem automatizadas, o método aumenta a eficiência e a consistência do desenvolvimento de mapas físicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Mapeamento Cromossômico
- Hibridização Fluorescente In Situ
Antecedentes
- Montagens genômicas provenientes do sequenciamento de DNA são frequentemente fragmentadas.
- Mapas cromossômicos físicos podem melhorar a qualidade das montagens genômicas.
- Técnicas inovadoras podem aumentar o rendimento no mapeamento físico.
- Sistemas automatizados podem reduzir o tempo de manipulação nas etapas laboratoriais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de alto rendimento para mapeamento cromossômico.
- Demonstrar a eficácia da imagem automatizada no desenvolvimento de mapas físicos.
- Melhorar a consistência dos resultados em comparação com métodos tradicionais.
Métodos Utilizados
- Preparação de cromossomos sob alta pressão a partir de ovários de mosquito.
- Marcação com sonda fluorescente utilizando o protocolo de marcação por nick translation.
- Hibridização fluorescente in situ automatizada.
- Obtenção automatizada de imagens para localização cromossômica.
Resultados Principais
- O protocolo produz espalhamentos cromossômicos consistentes e de alta qualidade.
- Sistemas automatizados reduzem significativamente o tempo necessário para o mapeamento físico.
- As imagens mostram efetivamente a localização de sondas de DNA marcadas com fluorescência.
- O método aumenta a produtividade em comparação com protocolos manuais.
Conclusões
- Este protocolo de alto rendimento representa um avanço significativo no mapeamento cromossômico.
- A automação melhora a eficiência e a consistência no mapeamento físico.
- As técnicas demonstradas podem ser aplicadas a outros estudos genômicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O mapeamento físico de cromossomos em alta escala aborda um gargalo crítico na qualidade da montagem do genoma, impactando diretamente análises genômicas subsequentes e estudos evolutivos. Ao permitir a localização rápida e consistente de sondas de DNA, esta abordagem contribui para reduzir os riscos na validação de alvos e melhora a confiança preditiva em fluxos de trabalho de genômica comparativa. A integração da automação reduz o tempo de manipulação manual e aumenta a reprodutibilidade, posicionando o método como uma capacidade escalável para projetos de sequenciamento em larga escala.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da arquitetura genômica e a clarificação da localização gênica em relação a características fenotípicas.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade na anotação gênica ao atribuir contigs a localizações cromossômicas específicas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao aumentar a confiança na inferência da função gênica por meio de mapeamento físico preciso.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz preparações cromossômicas padronizadas e de alta resolução adequadas para ensaios baseados em FISH reprodutíveis.
- Valor Operacional: Sistemas automatizados de coloração e imagem aumentam a produtividade e reduzem a variabilidade na detecção da localização da sonda.
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas espaciais quantificáveis que permitem comparação entre variantes genéticas ou condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Facilita a análise evolutiva e a reconstrução filogenética ao atribuir orientação e localização aos contigs de sequenciamento.
- Relevância para Modelos Pré-clínicos: Apoia estudos de competência vetorial ao permitir genômica comparativa entre espécies transmissoras e não transmissoras de doenças.
- Avanço Ajustado ao Risco: Melhora a qualidade da anotação do genoma, reduzindo falsos positivos em pipelines de identificação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde o sequenciamento inicial do genoma até a anotação e análise comparativa, especialmente quando é necessária uma resolução de mapa físico para resolver lacunas de montagem ou montagens incorretas.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre ordem genética, sintenia e evolução cromossômica em modelos relevantes para doenças.
- Triagem: Permite fluxos de trabalho padronizados e automatizados de FISH para validação de sondas e triagem de localização em alto rendimento.
- Análises: Gera dados espaciais e baseados em intensidade que permitem comparação quantitativa da ligação de sondas entre cromossomos ou amostras.
- Pesquisa Translacional: Conecta mapeamento físico à inferência evolutiva e à descoberta de biomarcadores em estudos de genômica comparativa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e automatizada de mapeamento físico aplicável a múltiplas espécies e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na anotação gênica e reduz a ambiguidade mecanicista na interpretação de dados genômicos.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da automação das etapas de coloração, hibridização e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir na seleção de alvos ao aumentar a confiabilidade da montagem do genoma e reduzir pistas falsas de origem biológica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos genômicos por meio da melhoria da qualidade da montagem e de insights evolutivos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em preparação de cromossomos, protocolos de FISH e sistemas automatizados de imagem.
- Depende do acesso a ferramentas de preparação de alta pressão, coloridores automatizados de lâminas e microscópios de fluorescência motorizados.
- Necessita padronização entre equipes para marcação de sondas, condições de hibridização e pipelines de análise de imagens.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização das etapas de espalhamento e desnaturação cromossômica.
- As limitações práticas incluem a dependência de cromossomos politênicos de alta qualidade e a adequação principalmente a genomas de dípteros com estágios politênicos.
