iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

O objetivo geral do experimento a seguir é obter um mapa abrangente do transcriptoma dos sítios de ligação de uma proteína ligadora de RNA com resolução individual de nucleotídeos. Isso é alcançado pela irradiação com UV de células vivas para promover a reticulação covalente entre proteínas e RNA in vivo como segundo passo. A proteína ligadora de RNA é imunopurificada sob condições rigorosas com o objetivo de recuperar os fragmentos de RNA reticulados.

A seguir, a transcrição reversa gera cDNAs que frequentemente são truncados no peptídeo ligado, o que preserva a informação sobre a posição da ligação cruzada dentro do RNA. Os resultados obtidos mostram todos os sítios de ligação dentro do transcriptoma com base no sequenciamento de alto rendimento da biblioteca de cDNA. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na biologia do RNA, como a forma pela qual a interação de diferentes proteínas ribonucleoproteicas regula o processamento do RNA. A principal vantagem desta técnica é que aumentamos tanto o desempenho quanto a resolução dos nossos mapas em todo o transcriptoma das interações proteína-RNA. Para começar o procedimento de ligação cruzada por UV em células de cultura tecidual.

Remova o meio de uma placa de 10 centímetros de células healer. Adicione seis mililitros de PBS gelado e coloque as placas sobre gelo. Uma placa é suficiente para três experimentos.

Remova a tampa e irradie as células. Uma vez em 254 nanômetros com 150 milijoules por centímetro quadrado, colete as células raspando-as das placas com um levantador de células e transfira dois mililitros da suspensão celular para cada um dos três tubos microcentrífugos para obter o pellet celular. Centrifugue-os em velocidade máxima por 10 segundos a quatro graus Celsius.

Em seguida, remova o sobrenadante, congele os pellets celulares em gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso. Adicione 100 microlitros de proteína, um dyna beads por experimento, a um tubo microcêntrifuga novo. Se estiver trabalhando com anticorpos de camundongo ou de cabra, utilize dyna beads de proteína G.

Lave as esferas duas vezes com tampão de lise, que pode ser encontrado no protocolo escrito em anexo. Ressuspender as esferas em 100 microlitros de tampão de lise com dois a 10 microgramas de anticorpo. Incube o tubo em temperatura ambiente sob rotação durante 30 a 60 minutos.

Em seguida, lave as microesferas três vezes com 900 microlitros de tampão de lise e deixe-as na última lavagem até que você esteja pronto para prosseguir. Realize a imunoprecipitação com a célula Thor no gelo. Re-suspenda em um mililitro de tampão de lise e transfira para um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro.

Prepare uma diluição de um para 500 do RNA um. Em seguida, adicione 10 microlitros juntamente com dois microlitros da turbo DNAse ao lisado celular. Incube as amostras por exatamente três minutos a 37 graus Celsius, agitando a 1.100 rotações por minuto, e transfira imediatamente para gelo.

Em seguida, centrifugue as amostras a quatro graus Celsius e 22.000 ×g por 20 minutos para clarificar o lisado; colete cuidadosamente o sobrenadante, deixando cerca de 50 microlitros do lisado com o pellet para imunoprecipitar as microesferas. Remova o tampão de lavagem e, então, adicione os lisados celulares preparados. Incube as amostras em rotação durante duas horas a quatro graus Celsius.

Descarte o agente SUP e lave as microesferas duas vezes com 900 microlitros de tampão de alta salinidade, que pode ser encontrado no protocolo escrito em anexo. Por fim, lave as microesferas duas vezes com 900 microlitros de tampão de lavagem. Em seguida, prossiga com a desfosforilação e adicione um ligador às extremidades 3' do RNA.

Para rotular as extremidades 5' do RNA, trabalhe atrás de uma blindagem de plexiglass. Remova o sobrenadante da última lavagem da reação de ligação do ligante e re-suspenda os beads em oito microlitros de mistura quente de PNK. Incube por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Remova a mistura quente de PNK e reus. Suspenda os grânulos em 20 microlitros de tampão de carregamento novo na concentração um vezes. Em seguida, incube a amostra em um misturador térmico a 70 graus Celsius por 10 minutos.

Coloque imediatamente a amostra sobre um ímã para precipitar as microesferas vazias. Carregue as amostras em um gel Biss de página nova de 4 a 12%, conforme as instruções do fabricante.

Além disso, carregue cinco microlitros de um marcador de peso molecular proteico pré-marcado. Execute o gel por 50 minutos a 180 volts. Transfira os complexos proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o equipamento de transferência úmida NOVA, conforme as instruções do fabricante.

Após a transferência, lave a membrana em tampão PBS. Em seguida, enrole-a em filme plástico e exponha-a ao filme a menos 80 graus Celsius. Realize exposições por 30 minutos, uma hora e durante a noite.

Em seguida, isole a região da membrana contendo os complexos proteína-RNA a partir dos RNAs de baixo peso molecular. Realize o experimento utilizando o auto-radiograma como máscara. Recupere o RNA da membrana mediante digestão com proteinase K e extração com fenol-clorofórmio.

Transcreva o RNA no sentido inverso utilizando um dos primers AYP para purificar o CDNA em gel. Misture seis microlitros da amostra de CDNA com seis microlitros de tampão de carga de ureia TBE duas vezes. Imediatamente antes de carregar as amostras em um gel.

Aqueça as amostras a 80 graus Celsius por três minutos. Em seguida, carregue as amostras em um gel de ureia TBE 6% pré-moldado, juntamente com um marcador de peso molecular baixo. Deixe o gel correr por 40 minutos a 180 volts, conforme descrito pelo fabricante, utilizando a corante superior e as marcas no suporte plástico do gel para orientar a excisão.

Corte três bandas com 120 a 200 nucleotídeos, 85 a 120 nucleotídeos e 70 a 85 nucleotídeos. Observe que o iniciador arc lip e a sequência L três juntos correspondem a 52 nucleotídeos da sequência clip. Adicione 400 microlitros de TE e triture o fragmento de gel em pedaços pequenos.

Usando o êmbolo de uma seringa de um mililitro, incubar os fragmentos de gel com agitação a 1.100 rotações por minuto durante duas horas a 37 graus Celsius. Colocar dois pré-filtros de vidro de um centímetro em uma coluna CoStar SpinX. Transferir a porção líquida da amostra para a coluna e centrifugar por um minuto a 13.000 rotações por minuto em um tubo de 1,5 mililitro.

Adicione 0,5 microlitros de glyco blue e 40 microlitros de acetato de sódio pH 5,5. Em seguida, misture a amostra. Adicione um mililitro de etanol a 100%.

Em seguida, misture novamente e precipite a amostra durante a noite a menos 20 graus Celsius. Por fim, circularize as moléculas de DNA CD para ligar a região adaptadora à extremidade cinco prima. Em seguida, relinearize e amplifique por PCR conforme o protocolo escrito anexo antes do sequenciamento da biblioteca do clipe ocular; o sucesso do experimento pode ser monitorado em duas etapas.

O autorradio gráfico do complexo proteína-RNA após a transferência para membrana e a imagem em gel dos produtos de PCR no autorradio gráfico das amostras com baixo teor de RNA, a radioatividade difusa deve ser observada acima do peso molecular da proteína nas amostras com alto teor de RNA. Essa radioatividade está mais concentrada próximo ao peso molecular da proteína. Quando nenhum anticorpo é utilizado na imunoprecipitação, nenhum sinal deve ser detectado.

Controles adicionais importantes para a especificidade da imunoprecipitação incluem a emissão de radiação UVE ou o uso de células que não expressam a proteína de interesse. A imagem em gel dos produtos de PCR deve demonstrar uma faixa de tamanho que corresponda à fração de CD NA. Observe que os iniciadores de PCR, P três Celexa e P cinco Celexa, introduzem 76 nucleotídeos adicionais ao tamanho do CD NA. Se nenhum anticorpo for utilizado durante a imunoprecipitação, nenhum produto de PCR correspondente deverá ser detectado.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada uma das 64 etapas é crítica e deve ser executada com precisão de cem por cento. Os dados de ICL podem ser integrados computacionalmente com ensaios funcionais em todo o transcriptoma. Isso pode, por exemplo, proporcionar insights sobre a regulação dependente da posição no processamento de RNA.

Para a análise computacional de dados, gostaríamos de remeter aos nossos trabalhos recentes publicados em colaboração com Nicholas KA, do Instituto Europeu de Bioinformática, e Bla Zupan, da Universidade de Liana. E agora é hora de você iniciar seus próprios experimentos. Divirta-se.