A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular
6 de maio de 2011
Ensaios de morte celular programada comumente usado em sistemas de mamíferos, tais como DNA laddering ou ensaios de TUNEL, muitas vezes são difíceis de reproduzir em plantas. Em combinação com um sistema de repórter GUS, propomos uma rápida, planta ensaio baseado transitória para analisar as propriedades morte potencial de genes específicos.
O objetivo geral deste procedimento é utilizar um sistema repórter Gus para analisar as propriedades de morte potenciais de genes específicos. Os genes de interesse são clonados em um cassete Gus e cultivados nos vetores de agrobactérias apropriados sob um promotor 35 s. Esses vetores são então transformados na linhagem de Agrobacterium LBA 44 0 4 e misturados com um cultivo contendo um cassete de expressão Gus para infiltração nas folhas de Nick Oceana Hamana.
A atividade de Gus pode ser avaliada visualmente por coloração histoquímica ou quantitativamente por ensaio fluorométrico de mug. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de escada de DNA ou ensaio TUNEL, comumente utilizado em sistemas de mamíferos, mas difícil de reproduzir em plantas, é que este é um ensaio transitório sensível e rápido baseado em plantas, que aproveita o fato simples de que células vivas são necessárias para que a expressão de gas ocorra. Demonstrando o procedimento hoje será Hua RAOs.
Um pesquisador pós-doutorando em nosso laboratório. A infiltração exige folhas saudáveis totalmente expandidas de plantas de Nicotiana benthamiana com três a seis semanas de idade, cultivadas a 25 °C. Planeje realizar este protocolo ao longo de oito dias. No primeiro dia, faça alisados a partir de estoces glicerinados de Agrobacterium tumefaciens contendo os vetores para o ensaio de morte celular e o vetor com a cassete de expressão Gus; inclua sempre um vetor vazio como controle negativo ou vetor placebo quando forem testadas múltiplas combinações de culturas.
Incube as placas a 28 graus Celsius por dois dias. No terceiro dia, inocule dois mililitros de LB seletivo com uma única colônia de cada placa. Incube cada cultura sob agitação a 28 graus Celsius por 24 horas a 200 RPM até atingir a densidade máxima de crescimento.
Após 24 horas de incubação, re-suspenda completamente a cultura por pipetagem se houver aglomeração, e aumente o volume total de cada cultura para 10 mililitros com LB seletivo fresco para induzir os genes de virulência do agrobactéria. Adicione acetona até 25 micromolar e incube cada cultura com agitação a 28 graus Celsius por mais 16 horas. O próximo passo é centrifugar cada cultura a 4.000 Gs durante 10 minutos à temperatura ambiente e re-suspender o pellet em 10 mililitros de meio de infiltração.
Não adicione acetona, centrifugue os cultivos novamente, mas agora reconstitua. Suspenda cada pellet em cinco mililitros de meio de infiltração contendo 100 micromolares de acetona. Agora, meça a DO em 600 nanômetros.
Concentrações tão baixas quanto 0,1 são aceitáveis, mas se forem superiores a 0,9, dilua até 0,9 com meio de infiltração e acetona antes da infiltração. Incube as culturas mais uma vez a 28 graus Celsius com agitação por três horas após a incubação. Misture as culturas experimentais e as culturas controle em uma proporção de um para um com a cultura contendo o cassete Gus.
Para cada cultura, utilize uma seringa de um mililitro sem agulha para infiltrar o selo de ABA ou a face inferior de folhas recém-emergentes. O volume de infiltração não é importante. Quando uma área de encharcamento aparecer, significa que quantidade suficiente foi adicionada; nesse caso, infiltre o controle negativo e o gene a ser analisado em folhas opostas da mesma planta, e depois infiltre mais duas plantas da mesma maneira.
Portanto, há plantas em triplicata para cada cultura. Três dias após a infiltração, é hora de coletar as folhas e analisar a expressão da proteína gust. Inicie a análise histoquímica infiltrando a vácuo toda a folha com o substrato xlu até que fique completamente saturada.
Agora, incubar as folhas no escuro, à temperatura ambiente, durante a noite ou até que apareça uma coloração azul distinta; quando a coloração azul for evidente, lavar as folhas com água destilada e incubar em etanol 70% durante a noite, até que a clorofila seja removida. No dia seguinte, lavar as folhas com água destilada e avaliar os níveis de expressão GUS.
Para quantificar a expressão de Gus, um substrato mug é convertido em um produto fluorescente mu, que pode ser medido começando pelo esmagamento de discos foliares infiltrados em um almofariz usando nitrogênio líquido. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de extração GUS, mantendo a amostra em gelo. Agora, centrifugue a suspensão a 14.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante contendo as proteínas solúveis totais, que inclui Gus.
Meça a concentração total de proteína solúvel utilizando um NanoDrop e ajuste a concentração para 100 microgramas de proteína total para cada amostra no tampão de extração Gus. Agora, adicione o substrato mug no tampão de extração Gus a cada amostra até uma concentração final de dois milimolares de mug. Um volume total de 100 microlitros por amostra deve ser suficiente, misture por pipetagem e incube a reação por uma hora a 37 graus Celsius.
Após uma hora, interrompa a reação adicionando 800 microlitros do tampão stop gusts. Para quantificar a mu, carrega-se 100 microlitros de cada amostra em uma placa de microtitulação, a qual é analisada em um leitor de placas; a fluorescência é medida com comprimentos de onda de excitação de 365 nanômetros e emissão de 455 nanômetros, e comparada a uma curva padrão. A atividade Guss pode então ser expressa como M de mu por micrograma de proteína solúvel total por minuto de reação. Diversos níveis de gust são detectados dependendo do construto utilizado, quando o cassete de expressão GUS é coinfiltrado com um regulador negativo da morte celular ou um gene anti-morte.
Níveis elevados de Gus são observados em comparação. Os níveis de Gus no controle com vetor vazio são muito mais baixos. Inversamente, quando um regulador positivo da morte celular ou um gene pró-morte é utilizado, observa-se uma redução acentuada na expressão de Gus em comparação com o controle com vetor vazio.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente uma semana. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta técnica é usada como uma etapa inicial para determinar o potencial de genes específicos. Trabalhos adicionais precisam ser realizados para confirmar esses resultados iniciais e para determinar o tipo de célula envolvida.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um ensaio transitório rápido baseado em plantas, utilizando um sistema repórter GUS para analisar as propriedades potenciais de morte de genes específicos. O método aborda os desafios de reproduzir ensaios de morte celular programada de mamíferos em sistemas vegetais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Ensaios de morte celular
- Engenharia genética
Antecedentes
- Ensaios de morte celular programada são cruciais para compreender processos celulares.
- Ensaios tradicionais como a eletroforese em gel em escada e TUNEL são difíceis de implementar em plantas.
- Os sistemas repórter GUS fornecem um método visual e quantitativo para avaliar a atividade gênica.
- A transformação mediada por Agrobacterium é uma técnica comum em estudos genéticos de plantas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio sensível e rápido para analisar a morte celular induzida por genes em plantas.
- Utilizar um sistema repórter GUS para avaliação visual e quantitativa.
- Melhorar a reprodutibilidade dos ensaios de morte celular em sistemas vegetais.
Métodos Utilizados
- Clonagem de genes de interesse em um cassete GUS.
- Transformação de Agrobacterium com o cassete de expressão GUS.
- Infiltração das folhas de Nicotiana benthamiana com o Agrobacterium transformado.
- Avaliação da atividade GUS por meio de coloração histoquímica e ensaios fluorométricos.
Resultados Principais
- O sistema repórter GUS indicou efetivamente a atividade gênica em células vegetais.
- A coloração histoquímica forneceu uma representação visual da atividade GUS.
- Ensaios fluorométricos permitiram a medição quantitativa da expressão gênica.
- O método demonstrou maior sensibilidade em comparação com ensaios mamíferos tradicionais.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para estudar a morte celular induzida por genes em plantas.
- Este método melhora a capacidade de analisar funções gênicas específicas de plantas.
- Aplicações futuras podem incluir estudos mais amplos das interações gênicas na biologia vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de repórter GUS baseado em plantas fornece um método rápido e sensível para triagem inicial da função gênica em vias de morte celular, abordando uma lacuna fundamental na tradução dos mecanismos de apoptose de mamíferos para sistemas vegetais. Ao permitir a investigação funcional em estágios iniciais de reguladores pró e anti-morte, o ensaio apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na biologia de descoberta. Seus resultados quantitativos e visuais facilitam a formulação de hipóteses e a priorização de alvos genéticos antes da alocação de recursos a modelos pré-clínicos subsequentes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar a expressão gênica a fenótipos de morte celular em um sistema dependente de células vivas.
- Valor Operacional: Oferece um sistema de expressão transitório e rápido para triagem funcional de candidatos gênicos sem transformação estável.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de leituras quantitativas da atividade de GUS que se correlacionam com função pró- ou antiapoptótica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras fluorométricas quantitativas da atividade GUS que permitem análises comparativas e de resposta à dose de construtos genéticos.
- Valor Operacional: Utiliza um protocolo padronizado de infiltração mediada por Agrobacterium, compatível com fluxos de trabalho de triagem em alta escala.
- Prontidão do Ensaio: Produz resultados consistentes e reprodutíveis, adequados para triagem de compostos ou bibliotecas genéticas em sistemas baseados em plantas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a análise funcional de genes na fase de descoberta com a validação pré-clínica, identificando reguladores conservados da morte celular entre reinos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a análise de truncamentos proteicos para inferir efeitos de modificações pós-traducionais, elucidando relações entre estrutura e função.
- Confiabilidade Preditiva: Possibilita a avaliação precoce da função gênica em um sistema relevante para a doença, reduzindo ambiguidades na seleção de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos e a identificação de compostos iniciais ao fornecer leituras funcionais que orientam decisões de prosseguimento ou interrupção antes do investimento em modelos mamíferos ou modelos pré-clínicos complexos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias ao associar a coexpressão gênica a alterações mensuráveis na atividade de GUS como um indicador da modulação da morte celular.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da coinfiltração controlada de construtos do gene de interesse e do repórter GUS, apoiando resultados quantitativos reprodutíveis.
- Análises: Oferece quantificação fluorométrica da atividade de GUS (MU por µg de proteína total por minuto), permitindo comparação objetiva de condições genéticas.
- Pesquisa Translacional: Apoia a extrapolação entre reinos ao analisar reguladores da morte celular de plantas (família BAG) e de mamíferos (BAX) em um mesmo formato de ensaio.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de modificadores genéticos da morte celular, adaptável a múltiplas classes de alvos e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir falsos positivos por meio de leituras de repórter dependentes de células vivas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio de protocolos definidos de infiltração, incubação e quantificação.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir o triagem rápido de alvos genéticos antes de se comprometer com validações que consomem muitos recursos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados funcionais precoces sobre candidatos a genes envolvidos em vias de morte celular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em expressão transitória mediada por Agrobacterium e no manejo de tecidos vegetais.
- Depende do acesso a leitores fluorométricos de placas e infraestrutura para coloração histoquímica para detecção de GUS.
- Necessita padronização dos passos de OD600 e indução com acetona entre culturas para ativação reprodutível dos genes de virulência.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a sistemas vegetais diferentes de Nicotiana benthamiana ou a genes repórter alternativos.
- Limita-se à triagem funcional inicial; exige validação ortogonal em sistemas mamíferos ou relevantes para doenças para maior confiabilidade translacional.
