PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Este vídeo mostra como fabricar scaffolds tubulares porosos e submetê-los a um condicionamento mecânico dinâmico para engenharia de tecidos arteriais. Isso é realizado primeiramente fabricando os scaffolds utilizando um elastômero biodegradável e o método de fusão por assalto. Os scaffolds são então preparados para o semeadura celular e montados em um sistema de biorreator.

No biorreator, células musculares lisas vasculares semeiam os escafóldos e são cultivadas. Semanas depois, o tecido é colhido e analisado por meio de microscopia eletrônica de varredura, coloração h e e e autofluorescência de elastina. O músculo liso resultante é tanto multicamadas quanto orientado perpendicularmente.

A principal vantagem desta técnica, semelhante à lixiviação de partículas, é utilizar o molde de vidro para fabricar uma estrutura tubular porosa com ácido hialurônico. Ao remover o molde, a estrutura é preparada a partir de um pedaço de tubo de vidro. Coloque o tubo em um suporte e despeje a solução de ácido hialurônico preparada no dia anterior dentro do tubo.

O ácido hialurônico flui lentamente ao longo da parede interna. Quando atingir a base do molde, vire o molde ao contrário. Repita este passo até que a parede interna do molde seja uniformemente revestida pela solução.

Após o revestimento, seque todas as formas de vidro preparadas em estufa a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas. Normalmente, quatro formas são preparadas simultaneamente enquanto as formas de vidro secam. Prepare os vertimentos de partículas de sal, moa e SVE as partículas de sal para 25 a 32 micrômetros.

No dia seguinte, monte o mandril de molde de vidro preparado, o tubo de PTFE, a manga termorretrátil e o anel de PTFE. Primeiro, insira o mandril em segmentos de 65 milímetros de comprimento de tubo de PTFE e aqueça-os a 120 graus Celsius por cinco minutos. Enquanto espera que o PTFE encolha, pré-aqueça um incubador de hibridização a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos.

Uma vez que o tubo tenha envolvido completamente os mandris, empurre a manga termorretrátil para o mandril de modo que ela se mova livremente. Em seguida, coloque o mandril dentro do molde de vidro e fixe o anel de A-P-T-F-E na extremidade inferior do mandril. Verifique se o anel de PTFE está bem ajustado à base do molde de vidro.

Em seguida, utilizando uma espátula e um funil de borracha de silicone, adicione mingaus de partículas de sal ao molde de vidro. Em seguida, bata levemente o molde com a espátula para obter uma distribuição uniforme das partículas e remova o excesso de sal. Agora desligue o incubador aquecido e carregue-o rapidamente com os moldes cheios de sal; o sal fundirá ao longo dos próximos 30 minutos, após o que seque os moldes em uma estufa a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte após o resfriamento, remova o mandril de aço inoxidável dos moldes empurrando-o para fora enquanto segura o anel de PTFE. Se necessário, use alicate de ponta fina. Em seguida, remova o anel de PTFE da base do molde.

Em seguida, aqueça as moldes para contrair a bainha e remova as bainhas encolhidas das moldes. Deixe as moldes esfriarem até que sejam utilizadas e armazene-as em um dessecador dentro de uma capela. Usando um conta-gotas, incline as moldes de vidro em 45 graus e goteje a solução de PGS em seu lúmen interno enquanto gira lentamente a molde.

Verifique se a solução de PGS escorre pela parede da forma. Se houver um ponto seco, adicione mais PGS. Agora, deixe o THF evaporar na câmara de exaustão por pelo menos 30 minutos. Uma vez que o THF tenha evaporado, cure as formas em uma estufa a vácuo.

Após curar por um dia, resfrie as moldes até a temperatura ambiente e mergulhe-as lentamente, na vertical, em água desionizada a 24 graus Celsius. Incliná-las muito rapidamente cria bolhas de ar, que rompem o suporte. Transfira cuidadosamente as moldes para o banho de água.

Posicione-os em um ângulo utilizando um tubo de silicone e deixe o ácido hialurônico dissolver por uma hora. Se após uma hora o ácido hialurônico não tiver se soltado do molde, com o molde ainda submerso, use uma espátula para empurrar lentamente o ácido hialurônico para fora a partir de ambas as extremidades e, em seguida, agite lentamente o molde. Agora, verifique se as estruturas não se deslocaram dentro do molde de vidro; caso tenham se movido, puxe lentamente a estrutura com pinça para soltá-la do molde.

Em seguida, lixivie as partículas de sal transferindo cuidadosamente os escafandros delicados para um banho de água desionizada com agitação suave. Este processo levará pelo menos três dias e exige a troca diária da água. Após a total remoção do sal, transfira cada escafandro para um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio com água desionizada e congele-os em uma caixa de gelo seco por uma hora. Coloque os tubos de centrífuga congelados em um liofilizador por três dias com as tampas abertas.

Uma vez liofilizados, armazene os suportes em um dessecador até que sejam utilizados. Comece cortando os suportes em comprimentos de 25 a 30 milímetros. Em seguida, prepare dois tampões de borracha de silicone passando tubos de PTFE pelos orifícios centrais de cada tampão.

Em seguida, corte comprimentos de um milímetro e meio do anel hs e deslize um comprimento para uma das extremidades do suporte. Empurre um tubo de PTFE ligado à rolha para dentro da mesma extremidade do suporte, com sobreposição suficiente apenas para ficar sob o anel HS, conectando firmemente o suporte ao tubo, contraia o anel HS em um forno e deixe o conjunto esfriar até a temperatura ambiente. Agora, um tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como a câmara do biorreator, é encaixado sobre o suporte e fixado na superfície interna da rolha de borracha de silicone.

Assim como antes, outro tubo de PTFE e rolha são fixados na outra extremidade do suporte com um anel hs para completar a câmara. A segunda rolha é conectada à outra extremidade do tubo de policarbonato. Em seguida, as superfícies externas das rolhas são ligadas a duas placas de liga de alumínio.

Insira dois hastes roscadas nos orifícios laterais de cada placa e fixe as placas com parafusos de polegar. Fixe o suporte ao biorreator. Em seguida, meça o comprimento visível de cada suporte, que é a distância entre os dois anéis hs, e calcule suas áreas superficiais internas.

Para o semeadura celular. Em uma autoclave, esterilize as câmaras, cada uma envolvida individualmente em folha de alumínio, juntamente com cada parte da unidade do biorreator. Após a esterilização, monte o biorreator dentro de uma cabine de cultura celular.

Pré-trate e lave o suporte com uma série de perfusões utilizando uma bomba peristáltica a um milímetro por minuto no circuito de fluxo. Inicie lavando com etanol 70%, etanol 50% e, em seguida, etanol 25%, durante uma hora cada. Após as três lavagens com etanol, realize uma lavagem com PBS por duas horas.

Por fim, perfundir o biorreator com meio de cultura para células musculares lisas durante 24 horas, após o que estará pronto para o semeadura celular e experimentação. Agora, seguindo as instruções no manuscrito acompanhante, semear o biorreator com 2 milhões de células por centímetro quadrado e, ao longo dos próximos 21 dias, trocar o meio do tubo e fazer ajustes na velocidade da bomba. Gradualmente, a pressão no constructo aumentará de cerca de quatro milímetros de mercúrio no primeiro dia de cultura para mais de 100 milímetros de mercúrio após duas semanas em cultura; após três semanas de cultura, colher as células e prepará-las para análise conforme especificado no manuscrito acompanhante.

Essas estruturas tubulares de PGS foram fabricadas pelo método de fusão com sal. Micrografias eletrônicas de varredura demonstraram que todas as estruturas apresentavam espessuras de parede homogêneas e não havia defeitos parciais em suas seções transversais. Macroporos e microporos distribuídos aleatoriamente foram observados na superfície luminal de todas as estruturas.

Após o cultivo celular, as camadas múltiplas de MLCs cresceram com orientação perpendicular à direção do fluxo. Além disso, as células e as proteínas de MCD cobriram completamente a luz de todas as estruturas de PGS. A autofluorescência da elastina também mostrou fibras elásticas organizadas circunferencialmente na superfície luminal da estrutura.

Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como fabricar um suporte tubular poroso, visualizar as células e cultivar o suporte utilizando um biorreator pré-projetado.