Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

O objetivo geral deste procedimento é criar uma matriz composta feita de biomateriais naturais que possa ser usada para entregar e diferenciar células-tronco, auxiliando na cicatrização de feridas. Isso é realizado primeiramente isolando células-tronco derivadas de adipócitos ou a SC de um animal de teste. Em seguida, as a SC são carregadas em microesferas de quitosana pré-fabricadas.

Em seguida, o gel de colágeno FIBRILADO é moldado, e as microesferas A-S-C-C-S-M são depositadas sobre o gel de colágeno. Por fim, o gel de fibrina PEG é moldado sobre o gel de colágeno A-S-C-C-S-M, e o meio é adicionado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a migração simultânea bidirecional de A SC da microesfera CSM para as matrizes de colágeno e de fibrina PEG.

Por meio deste procedimento, uma única fonte de células-tronco pode receber sinais diferenciais dos microambientes de colágeno e fibrina PEG, e ser diferencialmente estimulada a produzir fatores pleiotrópicos e formar uma rede de estruturas pré-vasculares. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como compósitos de material único ou substitutos dérmicos descelularizados, é que esses outros produtos não abordam ativamente a revascularização do produto pelo hospedeiro. Tivemos inicialmente a ideia para este método ao observar que o RAD A SE isolado tem a tendência de se diferenciar em direção a um fenótipo vascular quando cultivado em uma matriz de fibrina de porco.

Essa observação despertou a ideia de que uma única fonte de células-tronco poderia ser utilizada simultaneamente em um sistema composto por diferentes biomateriais. Após o isolamento e cultivo de células-tronco derivadas de adipócitos ou ASCs, a preparação de microesferas de quitosana ou CSMs e o carregamento das ASCs nas CSMs, prepare o hidrogel de polietilenoglicol e fibrina dissolvendo o peg modificado com succinil glutarato em quatro mililitros de solução salina tamponada com tris. Imediatamente antes do experimento, utilize um filtro de 0,22 mícron para esterilizar a solução.

Em um poço de cultura de uma placa de seis poços, misture 500 microlitros de solução estoque de fibrinogênio e 250 microlitros de solução estoque de PEG, e incube por 20 minutos em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, misture 250 microlitros de A-S-C-C-S-M previamente preparado com a solução de fibrinogênio pegilado, adicione imediatamente um mililitro de solução estoque de trombina e, usando uma pipeta, agite rapidamente uma ou duas vezes; imediatamente após, coloque a mistura de gel celular em uma placa de 12 poços e incube em câmara umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 10 minutos. A seguir, lave o fibrina peg resultante duas vezes com HBSS e incube com meio mínimo essencial alfa suplementado com 10% de soro bovino fetal em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, utilizando técnicas padrão de microscopia de luz ao longo de um período de 11 dias.

Observe a migração de células do A-S-C-C-S-M para a mistura de gel, com colágeno tipo I extraído de tendões de cauda de rato utilizando dois hidróxidos de sódio normais. Ajuste o pH para 6,8 e realize a fibrilação. Adicione a mistura de colágeno fibrilado, A-S-C-C-S-M, a uma placa de 12 poços e incube em incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após verificar que a fibrilação está completa, incubar os géis de colágeno A-S-C-C-S-M por até 11 dias em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Observar a migração de células do CSM para o interior do gel ao longo de um período de 11 dias utilizando técnicas padrão de microscopia, a fim de desenvolver o constructo bicamada para estudar as propriedades migratórias e de coindução de uma única fonte de células-tronco. Utilizando dois bioescafolds.

Prepare os géis de colágeno e de fibrina com PEG com as seguintes pequenas modificações: prepare um mililitro de colágeno a 7,5 miligramas por mililitro. Em seguida, transfira a mistura para um inserto de cultura tecidual de seis poços e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a completa fibrilação, sobreponha à superfície do colágeno 200 microlitros de cinco miligramas de A-S-C-C-S-M em meio de cultura.

Após as microesferas se sedimentarem sobre o gel, prepare o gel de fibrina PEG utilizando 250 microlitros de meio de cultura celular. Em seguida, sobreponha a solução de fibrinogênio pegilado e trombina sobre as camadas de colágeno A-S-C-C-S-M. Após a conclusão, incube as construções por 30 minutos em um incubador úmido com 5% de dióxido de carbono para obter a ativação completa.

Finalmente, adicione um mililitro de meio na câmara superior sobre o constructo e três mililitros de meio na câmara inferior. A caracterização de uma SC incorporada nesta estrutura revelou que CSMs carregadas com SC podem ser colocadas em sanduíche entre uma camada de colágeno e fibrina peg, simultaneamente, e receber sinais diferencialmente de ambos os ambientes extracelulares para prosperar em suas novas condições. Como mostrado aqui, o colágeno sustentou a capacidade das ASCs de permanecerem como células-tronco, conforme demonstrado pela expressão de stro um em verde, bem como por sua morfologia semelhante à de fibroblastos.

Em contraste, o fibrina PEG induziu as ASCs a se diferenciarem em um fenótipo avascular, conforme demonstrado por sua morfologia semelhante a tubos, mostrada aqui, completa com lúmen e expressão específica de células endoteliais do fator de von Willebrand, mostrado aqui em vermelho. Além disso, conforme demonstrado aqui, esses fenótipos observados pareceram ocorrer precocemente em cultura e foram mantidos por 11 dias. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco derivadas de adipócitos de rato, carregá-las em microesferas de quitosana e incorporá-las em um hidrogel bicamada utilizando biomateriais aprovados pela FDA.

Não se esqueça de que os biomateriais e células utilizados neste protocolo são derivados de animais e seres humanos e podem ser extremamente perigosos se estiverem contaminados com patógenos de seus hospedeiros. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual e técnicas de cultura celular assépticas, devem sempre ser adotadas ao realizar estes procedimentos.