Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans

O procedimento realiza restrição dietética no meio padrão baseado em ágar em *Caenorhabditis elegans* para estudar seus efeitos sobre longevidade, reprodução e metabolismo. Isso é realizado primeiramente medindo com precisão a concentração das bactérias que serão utilizadas como fonte alimentar. O segundo passo do procedimento consiste em diluir adequadamente a cultura bacteriana em concentrações apropriadas.

Em seguida, prepare placas SDR com bactérias mortas. Finalmente, monte experimentos SDR com uma população de vermes sincronizada por idade. Os resultados das medições de produção de prole e longevidade podem mostrar uma produção de prole retardada e reduzida, bem como um aumento na longevidade média.

A principal vantagem desta técnica em relação a 60 métodos como o Dian em meio AZA é que todo o experimento será realizado em uma placa sólida padrão baseada em AGA, utilizada pela maioria dos laboratórios com organismos termófilos para experimentos de restrição dietética, e é necessário estabelecer curvas de calibração separadas para cada linhagem bacteriana usada como fonte alimentar. Escolha uma única colônia da bactéria Escherichia coli OP50 a partir de um streak fresco em ágar LB e inocule três mililitros de cultura líquida em caldo LB em um agitador a 37 graus Celsius durante a noite. Prepare diluições seriadas de duas vezes da cultura noturna.

Em seguida, meça a absorbância de cada diluição a 600 nanômetros por espectrofotômetro em triplicata. Dilua ainda mais cada suspensão bacteriana, diluindo uniformemente 0,4 mililitros da suspensão bacteriana de cada diluição em uma placa de ágar LB de 100 milímetros e incube a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas. Conte o número de colônias bacterianas desenvolvidas em cada placa para calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro para cada amostra.

Agora, plote a DO 600 em função da concentração bacteriana e realize uma análise de regressão linear para estabelecer a relação entre os valores medidos de DO 600 e as concentrações de bactérias OP 50. Para este método, utiliza-se uma concentração bacteriana de um vezes 10 à 11ª UFC por mililitro na condição de alimentação ad libitum e um vezes 10 à 8ª UFC por mililitro como condição ótima de DR. No entanto, podem ser necessárias quatro a seis concentrações bacterianas diferentes para estabelecer uma relação completa dependente da dose.

Para SDR e suas respostas. Prepare um inóculo com uma única colônia de bactéria Escherichia coli OP50 em três mililitros de caldo LB líquido, cultivados em agitador a 37 °C por seis a oito horas. Transfira a cultura OP50 para um novo frasco contendo 500 mililitros de caldo LB e cultive durante a noite para que as bactérias atinjam a saturação, se necessário.

Prepare a diluição apropriada da cultura OP 50 para a medição da absorbância em OD 600. Para determinar a concentração bacteriana, pelletize as bactérias por centrifugação a 1500 Gs durante 20 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em uma concentração de um vezes 10 à 12ª UFCs por mililitro.

Agora, prepare culturas bacterianas de 10 mililitros em seis concentrações diferentes, variando de um vezes 10 à 12ª até um vezes 10 à 7ª UFC por mililitro. Pipete 0,2 mililitro da cultura bacteriana no centro de uma placa N GM solidificada de 60 milímetros. Evite tocar a superfície da placa com a ponteira da pipeta, pois arranhões na superfície permitem que os vermes se enterrem nos aerotaxis.

Coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 10 microlitros de 100 miligramas por mililitro de carbonato sódico e 10 microlitros de 50 miligramas por mililitro de canamicina a cada placa para inibir o crescimento das bactérias. Armazene as placas com diferentes concentrações de antibiótico que mataram as bactérias a quatro graus Celsius para uso futuro por até um mês.

É importante preparar e armazenar placas suficientes, preferencialmente do mesmo lote para toda a planta. Realize um experimento de um a dois dias antes para verificar a viabilidade das bactérias. Raspe algumas bactérias das placas SDR e espalhe sobre uma placa N GM vazia com carbônico, sein e antimicina.

Coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius por seis a oito horas e confirme a ausência de crescimento bacteriano. Para a maioria dos estudos relacionados à SDR, como análise de longevidade e perfilagem da produção de prole, a preparação de uma população de vermes sincronizada por idade é essencial. Use um coletor de vermes de platina para transferir 20 a 30 adultos reprodutivamente ativos para várias placas NGM comuns.

Com OP 50. Dependendo do número de ovos necessários para os experimentos, pode ser necessário um maior número de adultos. Incube as placas a 20 graus Celsius por quatro horas para permitir a postura de ovos.

Remova os adultos da placa e inspecione visualmente as placas em busca de ovos. Continue a incubar as placas a 20 graus Celsius para permitir que a prole se desenvolva até o estágio adulto tardio L4/dia um. Normalmente, isso leva três dias para vermes selvagens N2 a 20 graus Celsius.

Para análise de longevidade. Transfira 10 a 12 vermes adultos do dia um para uma placa SDR para iniciar a restrição dietética. Para obter poder estatístico suficiente, utilize um total de 60 a 100 vermes para cada condição de SDR.

Avalie a viabilidade de cada verme a cada dois ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Importante: transfira os vermes para placas SDR frescas a cada dois dias para evitar a inanição. Esta curva de calibração mostra a concentração de OP50 em relação à DO600.

A equação gerada pela análise de regressão linear pode ser usada para todos os cálculos futuros das concentrações bacterianas OP 50. Este estudo analisa o efeito de tratamentos crônicos com SDR sobre a longevidade média de diferentes linhagens de vermes, em comparação com a resposta dependente da dose normal de vermes selvagens ao SDR. O efeito do SDR sobre a longevidade é parcialmente suprimido pela superexpressão de DR dois, enquanto a mutação DAF 16 MU 86 não tem efeito sobre a extensão da longevidade induzida por SDR.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o Dian na jogada padrão baseada em AGA na elegância marinha.