Básico
10 de junho de 2012
A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo C. elegans Torná-lo um organismo modelo agradável para trabalhar. A possibilidade de vermes sincronização permite que o trabalho com uma quantidade significativa de sujeitos na mesma fase de desenvolvimento, o que facilita o estudo de um processo particular em muitos animais.
Neste vídeo, vamos mostrar como sincronizar C. elegans no estágio de primeira instar. Este é um método simples, mas muito comum, sendo bastante útil, especialmente se você ainda é iniciante.
Se você é um especialista em C, pode encontrar aqui algumas dicas para otimizar este protocolo. A base da sincronização de vermes reside na resistência relativa de larvas e embriões à solução alcalina de hipoclorito em comparação com adultos. Esses vermes adultos, contendo muitos embriões em seu interior, são incubados com uma solução de hipoclorito, de modo que são mortos e apenas os embriões permanecem.
A segunda parte da sincronização é alcançada pela ausência de alimento, de modo que, embora os embriões eclodam em momentos diferentes, eles não desenvolvem além do estágio L um. O primeiro passo para iniciar um protocolo de choque é ter vermes no estágio de postura de ovos, com vários ovos espalhados pela placa. Use M nove para recuperar os adultos com o objetivo de colheita.
Além disso, os embriões que já migraram para a superfície da placa podem ser removidos com um material macio, como um pedaço de filme de raio X, lavando as bactérias com várias lavagens em M nove. Geralmente, algumas lavagens são suficientes. Após a lavagem dos vermes, é hora de adicionar a solução de branqueamento recém-preparada de acordo com nossas preferências.
Controle o tempo de incubação enquanto agita o tubo. Você pode monitorar a emergência dos adultos sob o microscópio estereoscópico. Assim que quase não houver mais cadáveres, interrompa a reação adicionando M nove até que o tubo fique completamente cheio.
Para finalizar o protocolo, realize pelo menos três lavagens. Com M nove, os ovos são incubados com agitação contínua durante a noite em tampão M nove, o que permite a eclosão, mas impede o desenvolvimento posterior dos vermes. Embora a sincronização possa ser realizada em qualquer temperatura entre 15 e 25 graus, recomenda-se 15.
Como o desenvolvimento é mais lento, como mencionamos durante seu desenvolvimento, elegans passa por quatro estágios larvais antes da fase adulta, cujo tempo depende da temperatura na qual é criado. Embora o C. elegans tolere temperaturas de crescimento que variam de 15 a 25 graus, a taxa de crescimento é maior.
A temperatura mais alta aqui, é possível observar como, após 24 horas, os estágios em que os vermes se encontram são diferentes. A 15 e 25 graus, após 48 horas a 25 graus, já observamos embriões. No entanto, precisamos esperar mais de 80 horas para ver embriões na superfície das placas.
Com vermes cultivados a 15 graus para obter resultados ideais, diversos aspectos devem ser levados em consideração ao realizar um experimento de blitzing. Também é importante reconhecer os vermes que estão no estágio desejado para a realização do experimento. Assim, mostraremos como distinguir os estágios, seja por tamanho, microscopia de contraste de interferência diferencial ou coloração.
Neste gráfico, é possível observar a taxa de crescimento dos vermes de GaN em função da temperatura, como mencionamos, sendo muito mais rápidos a 25 graus. Existe uma correlação entre o tamanho do animal e o desenvolvimento em elementos marinhos. Com o software apropriado, os animais podem ser medidos e posteriormente classificados no estágio de desenvolvimento adequado.
De acordo com este gráfico, no entanto, o local é um marcador grosseiro das fases de desenvolvimento. Um estadiamento mais preciso pode ser alcançado pela observação de partes dos mares, anatomia que pode ser utilizada e reconhecida tanto por interferência diferencial, microscopia de contraste de fase, quanto pela coloração DPI. Em nosso laboratório, utilizamos este protocolo para sincronizar vermes para diferentes experimentos como micro ovos em coloração mono, visualização in situ e coloração up is.
Além disso, este Protocolo também ajuda a eliminar contaminações. O contraste de interferência diferencial ou a microscopia nomar são utilizados para realçar o contraste. Em amostras transparentes não coradas, os animais são montados vivos sobre uma base de 2% Agros, que pode ser preparado previamente e armazenado a quatro graus quando necessário.
Pode ser derretido e mantido a 65 graus. Uma vez que o agros esteja derretido, coloque uma fita adesiva em uma lâmina e posicione-as em ambos os lados de uma terceira lâmina. Cuidadosamente, pegue um pouco do agros e coloque uma gota na lâmina sem fita adesiva.
Cubra os ágros com outra lâmina colocada transversalmente. Uma vez que o trajeto esteja sólido, separe as duas lâminas deslizando cuidadosamente uma sobre a outra. A almofada aderirá a uma delas.
Adicione um pouco de Amazon na placa para manter os vermes imobilizados. Escolha alguns vermes sob o microscópio estereoscópico e transfira-os para a gota de lele. Evite danificar o trajeto.
Retire um lamínula e adicione um pouco de esmalte nas bordas. Coloque cuidadosamente a lamínula sobre esta lâmina, evitando a formação de bolhas. O preparo pode ser observado imediatamente ao microscópio. Uma das características mais simples da anatomia de c Elgan é Alva.
Por exemplo, um aava com formato de três de Natal é característico do estágio L quatro. Informações detalhadas sobre a anatomia de c elgan durante o desenvolvimento podem ser obtidas em www.orla.org. A coloração com tapis é um procedimento comum para identificar células individuais.
A fixação com o túnel é um método rápido para fixar vermes. Para coloração dappy, adicione primeiro uma gota de tampão M nove à superfície de uma lâmina de microscópio. Colete alguns vermes diretamente da placa e transfira-os para a gota de M nove.
Elimine o excesso de meio M9 com uma pipeta ou com um tecido macio. Adicione um túnel aos vermes. Repita o procedimento.
Uma vez que a primeira gota esteja seca, adicione um pouco de meio de montagem com API e o excesso antes de levar o preparo ao microscópio. O desenvolvimento do go pode ser facilmente observado em stent quente com api.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um método simples, porém eficaz, para sincronizar o nematódeo C. elegans no primeiro estágio larval. A sincronização permite aos pesquisadores estudar processos de desenvolvimento em uma população uniforme de vermes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Organismos Modelo
Contexto
- C. elegans é um organismo modelo amplamente utilizado devido à facilidade de manutenção.
- A sincronização de vermes facilita o estudo de processos de desenvolvimento específicos.
- O método baseia-se na resistência diferencial de embriões ao hipoclorito alcalino.
- Vermezinhos adultos são tratados para isolar embriões com fins de sincronização.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo para a sincronização de C. elegans na primeira fase larval.
- Ajudar iniciantes a compreender o processo de sincronização.
- Oferecer dicas de otimização para pesquisadores experientes.
Métodos Utilizados
- Incubação de C. elegans adultos com solução de hipoclorito alcalino.
- Isolamento de embriões de vermes adultos.
- Sincronização de embriões para garantir estágios de desenvolvimento uniformes.
- Demonstração visual do protocolo em formato de vídeo.
Resultados Principais
- O método isola efetivamente embriões para sincronização.
- Os pesquisadores podem trabalhar com um grande número de vermes no mesmo estágio de desenvolvimento.
- Dicas de otimização aumentam a eficiência do protocolo.
- O formato em vídeo auxilia na compreensão do procedimento.
Conclusões
- A sincronização de C. elegans é uma técnica valiosa na biologia do desenvolvimento.
- O protocolo é acessível para iniciantes e benéfico para pesquisadores avançados.
- A sincronização eficaz permite condições experimentais mais controladas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A sincronização e a observação precisa de populações de Caenorhabditis elegans permitem estudos desenvolvimentais e moleculares com alta confiabilidade, essenciais para a validação inicial de alvos e a redução de riscos mecanicistas. O estadiamento uniforme favorece triagens fenotípicas reprodutíveis e o desenvolvimento de ensaios quantitativos, impactando diretamente a confiança preditiva em pipelines de descoberta. Esses métodos fundamentais sustentam fluxos de trabalho escaláveis e multifuncionais para pesquisa translacional e alinhamento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias de desenvolvimento e função gênica em um sistema conservado e de fácil manipulação.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer populações sincronizadas para testes hipotéticos controlados.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de estadiamento e observação reprodutíveis do desenvolvimento.
- Aprimora a confiabilidade preditiva para decisões de triagem de portfólio em etapas subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece populações padronizadas e correspondentes aos estágios para telas de RNAi de alto rendimento e ensaios moleculares.
- Melhora a reprodutibilidade do ensaio e a saída quantitativa ao minimizar a variabilidade no desenvolvimento.
- Permite avaliação confiável de compostos e reutilização da plataforma em diversas modalidades experimentais.
- Apoia a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem escaláveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a vias relevantes para doenças devido à conservação evolutiva dos processos celulares.
- Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, apoiando o desenvolvimento de sistemas modelo robustos.
- Reduz o risco translacional ao permitir leituras fenotípicas e moleculares precisas em populações sincronizadas.
- Facilita a descoberta de biomarcadores e estudos mecanicistas relevantes para a biologia humana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A sincronização e observação de C. elegans se integram na interface entre descobertas iniciais, identificação de compostos promissores e pesquisa pré-clínica, apoiando experimentações baseadas em hipóteses e o desenvolvimento escalonável de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a clarificação de vias por meio do estabelecimento controlado de estágios de desenvolvimento.
- Triagem: Fornece populações prontas para ensaios e reprodutíveis para triagem quantitativa e perfilagem molecular.
- Análises: Permite a medição da progressão do desenvolvimento, de marcadores específicos de células e de fenótipos quantitativos.
- Pesquisa Translacional: Oferece uma ponte para modelos pré-clínicos aproveitando a biologia conservada e saídas fenotípicas robustas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável para diversas necessidades experimentais e de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de estágio inicial.
- Valor Operacional: Padroniza o estadiamento do desenvolvimento, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e o avanço eficiente em termos de capital da carteira de projetos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço robusto de alvos validados.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manipulação de nematoides, microscopia e estadiamento do desenvolvimento.
- Requer acesso a microscopia estereoscópica e de contraste de interferência diferencial para observação precisa.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de sincronização e estadiamento.
- Pode ser necessária adaptação para formatos específicos de ensaio ou requisitos do sistema modelo.
- Limitações práticas incluem sensibilidade à temperatura e a necessidade de temporização precisa durante a sincronização.
