Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a microscopia fotoacústica com resolução óptica in vivo, ou OR-PAM, da microcirculação, que é não invasiva e dispensa marcadores. Isso é realizado primeiramente anestesiando o animal experimental. O segundo passo do procedimento consiste em posicionar a região de interesse transladando a cabeça de imagem do microscópio de resolução óptica; em seguida, os parâmetros de varredura são definidos e a aquisição de imagens é iniciada.

No fim, as distribuições da concentração total de oxigênio e da saturação de oxigênio da hemoglobina são obtidas por meio do cálculo dos dados experimentais multiespectrais. A microscopia fotoacústica de resolução óptica baseia-se na excitação a laser e na detecção ultrassônica. Um feixe de laser pulsado é focalizado no tecido biológico.

A absorção de luz gera aquecimento transitório e emissão subsequente de ultrassom, que é detectada para formar uma imagem. A vantagem única do, ou Pam, é a detecção livre de fundo e sensibilidade excelente à absorção óptica. Em contraste, as tecnologias de microscopia por reflexão óptica existentes são principalmente sensíveis ao espalhamento óptico ou à fluorescência, sendo capazes de fornecer, in vivo, imagens de alta resolução sem marcação baseadas na absorção óptica. O RPM tem encontrado amplas aplicações biomédicas em neurologia, oftalmologia, biologia vascular e dermatologia.

A microscopia fotoacústica de resolução óptica, ou pamm, consiste em componentes ópticos e ultrassônicos. A fonte de irradiação óptica é um laser de corante bombeado por um laser de pulso de estado sólido. O feixe de laser de saída é atenuado por um filtro de densidade neutra e acoplado a uma fibra óptica de modo único para entrega de luz, permitindo a varredura mecânica da cabeça de imagem do microscópio em vez do objeto vivo, a fim de acoplar efetivamente o feixe de laser multímodo a uma fibra óptica de modo único.

Primeiro, é filtrado por um orifício de 50 micrômetros de diâmetro. O orifício é posicionado ligeiramente afastado do foco da lente condensadora para igualar seu diâmetro ao do feixe em modo fundamental. Para criar um foco óptico quase limitado pela difração, a saída da fibra de modo único é colimada e preenche a abertura traseira de uma objetiva de microscópio.

A detecção ultrassônica envolve um combinador acusto-óptico caseiro conectado a um transdutor ultrassônico. O combinador alinha coaxialmente a irradiação óptica e a detecção acústica. Uma cavidade esférica é usinada na parte inferior do combinador para produzir uma lente acústica com uma abertura numérica de 0,5 na água, o que fornece um diâmetro focal acústico de 43 micrômetros na frequência central de 50 megahertz.

Para o primeiro alinhamento, é útil utilizar ultrassom por eco de pulso para determinar a posição do plano focal acústico. A cabeça de imagem é ajustada verticalmente até que o sinal ultrassônico máximo de eco de pulso seja observado. Para maximizar a sensibilidade de detecção, os focos óptico e acústico são alinhados. Confocal.

Um alvo absorvedor de luz, como um pedaço de fita isolante preta, é colocado no plano focal acústico. Em seguida, a posição focal óptica é ajustada para maximizar o sinal fotoacústico. O sistema PAM também inclui amplificadores eletrônicos e conversor analógico-digital, um scanner mecânico e um controlador de scanner.

O sinal digitalizado é transferido para um computador para formação da imagem. O software converte os dados brutos em uma sequência de imagens bcan transversais. Conforme a cabeça do microscópio realiza uma varredura em raster sobre o objeto, as imagens registradas podem então ser exibidas como imagens transversais individuais, imagens de projeção de amplitude máxima em 2D ou reconstruções em 3D.

Um tanque de água é usado para acomodar a cabeça de imagem do microscópio. Uma janela de imagem é recortada em uma placa de Petri e selada com uma membrana de polietileno transparente à ultrassonografia e à luz. A onda fotoacústica gerada a partir do objeto é acoplada acusticamente ao detector de ultrassom primeiramente por um gel ultrassônico entre o objeto e a membrana de polietileno, e depois pela água desionizada presente na placa de Petri.

Essas invenções e aplicações de lasers de óptica disponíveis e do transdutor de ultrassom compõem o sistema PAM. No próximo segmento, iremos obter imagens da microvasculatura de um camundongo vivo com este sistema. Se o animal a ser imageado não for um camundongo nu, 24 horas antes do experimento, é ideal realizar a depilação.

Assim, a irritação na vasculatura da pele é recuperada. Anestesie o camundongo com vapor de isoflurano a 3% em oxigênio de grau médico. A taxa de fluxo típica está entre um e 1,5 litro por minuto.

Dependendo do peso corporal do animal. Mantenha a anestesia com 1% de ISO fluoreto durante todo o experimento; realize um aperto no dedo da pata para garantir que o camundongo esteja completamente anestesiado. Transfira o camundongo para uma plataforma estereotáxica com um tapete aquecido para manter sua temperatura corporal a 37 graus Celsius.

Agora aplaneie a orelha sobre a placa de plástico. Em seguida, aplique uma camada de gel ultrassônico sobre a orelha. Evite aprisionar bolhas de ar dentro do gel.

Aplicar também pomada oftálmica nos olhos para prevenir ressecamento ou danos acidentais pelo laser. Evite tocar diretamente o olho com o aplicador. Em seguida, posicione a orelha sob a janela de imagem e eleve lentamente o estágio do animal até que o gel de ultrassom entre em contato com a parte inferior da membrana.

O contato suave é necessário porque pressionar a orelha contra a membrana pode afetar o fluxo sanguíneo na orelha. Em seguida, tome algumas precauções com o animal para monitorar seu estado fisiológico. Prenda um oxímetro de pulso na pata ou na cauda do camundongo.

Agora, abaixe a cabeça de imagem até que a lente acústica esteja imersa em água desionizada e remova as bolhas aprisionadas sob a lente acústica. Configure o laser no modo de disparo externo e inicie a varredura de teste. Ajuste a posição Z da cabeça de imagem até que os focos óptico e acústico duplos estejam posicionados no centro da orelha.

Agora defina os parâmetros de digitalização e inicie a aquisição formal de imagens. Para medir a concentração total de hemoglobina, ajuste o comprimento de onda a um ponto ISO espástico no qual a oxiemoglobina e a desoxiemoglobina apresentem coeficientes molares de extinção iguais.

Para medir a saturação de oxigênio da hemoglobina, ajuste o segundo comprimento de onda para onde os coeficientes molares de extinção da oxiemoglobina e da desoxiemoglobina apresentam uma diferença acentuada. Quando terminar, limpe a orelha do camundongo e coloque-o em uma incubadora. Com a temperatura ambiente ajustada a 37 graus Celsius, quando acordar, devolva o camundongo naturalmente ao biotério.

Esta imagem de projeção de amplitude máxima mostra a anatomia vascular da orelha de um camundongo nu vivo, obtida com ou Pam em 570 nanômetros. Esta imagem de projeção mostra a saturação de oxigênio da hemoglobina na mesma orelha. É calculada a partir das imagens adquiridas em um comprimento de onda isoespástico de 570 nanômetros e um comprimento de onda dominante da absorção de desoxiemoglobina de 561 nanômetros.

Uma análise mais detalhada da região destacada mostra a resolução do oramm. Um leito capilar densamente compactado é claramente resolvido. Neste vídeo, demonstramos o protocolo experimental típico para ORPM, incluindo a configuração do sistema, o alinhamento do sistema, o procedimento experimental in vivo e o esquema de imagem funcional.

Um dos aspectos mais importantes no projeto e funcionamento do instrumento é o alinhamento confocal óptico-acústico, que é crucial para a sensibilidade de imagem, resolução óptica na microscopia fotoacústica em combinação com microscopia fotoacústica de resolução acústica de alta penetração e tomografia computadorizada fotoacústica, prometendo imagem funcional e molecular in vivo em múltiplas escalas, desde unhas de órgãos, células, tecidos e até órgãos completos, podendo ser visualizados com o mesmo contraste. Essa origem, como a escalabilidade de imagem, possui o potencial de revolucionar pesquisas em sistemas multiescalares, biologia e tradução, desde descobertas laboratoriais microscópicas até a prática clínica macroscópica.