Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens tridimensionais em chip sem lentes de espécimes biológicos em um grande volume de imagem. Isso é realizado primeiramente colocando a amostra diretamente sobre o chip do sensor e fornecendo iluminação parcialmente coerente. O segundo passo consiste em deslocar lateralmente a fonte de luz para diferentes posições para registrar.

Imagens holográficas do amostra com deslocamento de subpixels. Próximos subpixels deslocados. As imagens holográficas são registradas em múltiplos da iluminação para imageamento tomográfico.

O passo final é o processamento de dados, no qual o conjunto de dados adquirido é digitalmente reconstruído para obter, em última instância, imagens tomográficas tridimensionais da amostra. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia óptica convencional, é que ela fornece imagem de alto rendimento em uma arquitetura compacta. Isso torna nossa plataforma particularmente útil para integração com plataformas de chip em lab-on-a-chip.

Neste relatório, descreve-se a configuração básica de imagem para uma implementação em bancada voltada à tomografia de amostras estáticas. Um monocromador com lâmpada de xenônio foi ajustado para fornecer uma saída com largura espectral aproximada de um a 10 nanômetros em torno de um comprimento de onda central de 450 a 650 nanômetros. Essa saída parcialmente coerente é então acoplada a uma fibra óptica multimodo para entregar luz parcialmente coerente ao sistema.

A fibra óptica é montada em uma plataforma de rotação motorizada para alterar o ângulo de iluminação. A plataforma motorizada com a fonte de luz acoplada é montada em uma plataforma linear bidimensional XY, utilizada para realizar deslocamentos no plano da fonte de luz em um determinado ângulo para detecção. Utiliza-se uma matriz de sensores A-C-M-O-S com cinco megapixels e tamanho de pixel de 2,2 mícrons.

O detector é usado para registrar imagens holográficas de campo amplo de amostras. É fundamental que a matriz de sensores esteja posicionada no mesmo plano axial do eixo de rotação da fonte de luz para garantir que verifiquemos se o sensor recebe luz suficiente em grandes ângulos de iluminação. Embora a tomografia óptica sem lente possa imaginar uma variedade de objetos, como células e microrganismos, os princípios básicos são demonstrados aqui por meio da microscopia tridimensional de uma amostra de embrião de mar usando um bisturi ou uma espátula.

Retire um pequeno pedaço de ágar da placa de Petri contendo o cultivo de órgãos seladores. Um pedaço cúbico de vários milímetros em cada dimensão conterá centenas de nematoides. Coloque o pequeno fragmento de ágar em um tubo de polipropileno contendo um mililitro de água desionizada.

Vortex suavemente por 30 segundos a um minuto. Após 10 a 15 minutos, o verme deve sair do ágar e mover-se para a água desionizada. Observe que os vermes são pequenos demais para serem vistos aqui, com o objetivo de imobilizá-los temporariamente, e um mililitro de cinco a 10 milimolar de Lima.

Então, deixe a solução em repouso por 10 minutos. Pipete de cinco a 10 microlitros da amostra a partir do fundo do frasco e coloque-a entre duas lamínulas. Essa amostra, contendo um grande número de vermes temporariamente imobilizados, pode ser posicionada sobre o detector para iniciar a aquisição de dados.

Para fins de demonstração, os passos da aquisição de imagens para um experimento típico de tomografia óptica sem lente ou LOT são resumidos nesta seção; no entanto, todo o processo foi automatizado utilizando a interface personalizada desenvolvida no LabVIEW. Para iniciar os passos manuais, ajuste o ângulo inicial do estágio de rotação para menos 50 graus, onde zero graus corresponde à posição vertical da fonte de luz. Ajuste a posição inicial do estágio XY para zero zero, que é a posição inicial.

Ajuste o tempo de exposição do detector para utilizar ao máximo sua faixa dinâmica, de modo que a imagem fique o mais brilhante possível sem nenhum pixel saturado, sem alterar o ângulo do estágio de rotação. Capture nove imagens para cada imagem. Mova o estágio XY para uma nova posição em uma grade quadrada de três por três, de forma que cada imagem se desloque aproximadamente um quarto de pixel em relação à anterior.

Adquirir mais imagens em cada ângulo pode melhorar a resolução, dependendo do tipo de objeto e da relação sinal-ruído. Após coletar nove imagens no ângulo inicial, ajuste a posição do estágio XY de volta à posição zero zero. Em seguida, aumente o ângulo do estágio de rotação em incrementos de dois graus até atingir 50 graus positivos.

Após cada incremento em cada novo ângulo, repita os passos descritos. Os incrementos angulares podem ser mais finos ou mais grossos, dependendo da otimização entre o tempo de aquisição e a resolução da imagem. Após a aquisição dos dados, um conjunto de 459 imagens é obtido, contendo nove imagens com deslocamento de subpixels para cada um dos 51 ângulos diferentes de iluminação.

Cada conjunto de nove imagens é processado digitalmente usando algoritmos de super-resolução de pixel para obter uma projeção de alta resolução. Os resultados da super-resolução de pixel por holograma e ângulo são então reconstruídos digitalmente para obter 51 imagens de projeção. O processamento dos dados é mostrado aqui utilizando um laptop.

A reconstrução levaria menos de um segundo para todo o campo de visão utilizando unidades de processamento gráfico. Esse conjunto de 51 imagens de projeção é então retroprojetado usando o plugin Tom OJA. Para o Image J, as imagens de projeção são primeiro carregadas no Image J, após o que o plugin Tom OJ é invocado.

Uma tabela de consulta que fornece o ângulo de visualização para cada imagem de projeção é carregada para o OJ. Utilizando o método de retroprojeção ponderada, podem ser obtidas imagens tomográficas tridimensionais do espécime. O grande campo de visão da tomografia óptica sem lentes é demonstrado aqui, já que a amostra é colocada diretamente sobre o arranjo de detectores. Imagens holográficas dos objetos podem ser registradas em um campo de visão de 24 milímetros quadrados, que pode ser ainda maior com o uso de arranjos de detectores emergentes com áreas ativas maiores.

Embora o tamanho do pixel da matriz do detector limite a resolução das imagens holográficas registradas, técnicas de super-resolução de pixel atenuam esse problema. Aqui são apresentados hologramas com super-resolução de pixel, juntamente com as imagens de projeção reconstruídas que oferecem resolução espacial submicrométrica para três ângulos diferentes de iluminação. As imagens de projeção podem ser combinadas utilizando técnicas de reconstrução de imagens tomográficas para calcular as tomografias do espécime. São mostradas aqui três imagens em corte no plano XY através da região anterior do verme, nas quais o tubo faríngeo é visível apenas no corte em Z igual a oito mícrons, como esperado para essa estrutura aproximadamente cilíndrica com diâmetro externo aproximado de cinco mícrons.

Além disso, a imagem em corte transversal no plano XZ mostra claramente as bordas do verme e do tubo faríngeo interno, demonstrando o sucesso da imagem tridimensional da faringe. Com seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores realizarem microscopia tridimensional em volumes de imagem de dezenas de milímetros. Portanto, a tomografia óptica sem lentes pode ser uma ferramenta útil para aplicações de imagem de alto rendimento em plataformas de chip tipo Lebanon.