Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

O objetivo geral deste procedimento é eletroporar implantes retinianos de camundongo com repórteres transcricionais fluorescentes e quantificar seus níveis de expressão. Isso é realizado primeiramente isolando o tecido retiniano de camundongo neonatal por meio de dissecação. O segundo passo do procedimento é eletroporar a retina com construtos de repórter de DNA fluorescente.

O terceiro passo do procedimento é cultivar as retinas eletroporadas como implantes por oito dias. O passo final do procedimento é coletar o explante retiniano e quantificar os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os níveis relativos de expressão de diferentes construtos repórter de promotor na retina em desenvolvimento de camundongo por meio da eletroporação de x explantes, seguida de análise quantitativa de dados.

Meu nome é Joe Corbo e sou membro do corpo docente do Departamento de Patologia e Imunologia da Escola de Medicina da Universidade de Washington em St. Louis. Hoje vamos apresentar um protocolo em vídeo demonstrando a técnica de eletroporação em explantes de retina de camundongos recém-nascidos, com o objetivo de quantificar a atividade de elementos reguladores cis específicos de fotorreceptores, e este protocolo será demonstrado por uma estudante de pós-graduação do meu laboratório, Cindy Montana. Primeiramente, esterilize a câmara de eletroporação e todos os instrumentos com etanol 70% em preparação para a coleta dos olhos.

Desinfete as luvas e a superfície da bancada com etanol e mantenha condições estéreis durante todo o procedimento. Em seguida, em uma capela de cultura celular, pipete seis mililitros de meio de dissecção para uma placa de Petri estéril de 60 milímetros e três mililitros de meio para duas placas estéreis de 35 milímetros. De volta à bancada, desinfete a cabeça e o pescoço de um filhote de camundongo recém-nascido com etanol a 70%.

Após decapitar rapidamente a cabeça com tesoura, transfira a cabeça para uma placa estéril de 100 milímetros, corte o couro cabeludo com uma tesoura pequena para expor os olhos sob um microscópio estereoscópico. Usando pinças curvas, retire suavemente o olho da órbita e, em seguida, coloque o olho em uma placa de 35 milímetros contendo Meio_de_Dissecação. Continue a coletar olhos de modo que haja três a quatro olhos por alíquota de DNA a ser eletroporada, mantendo os olhos e o meio de dissecação à temperatura ambiente até o término.

Desinfete uma lâmina de barbear e a embalagem de uma pipeta de transferência plástica estéril com etanol 70%, e em seguida use a lâmina para cortar a ponta da pipeta em uma altura suficiente para que um olho inteiro possa ser pipetado. Usando a pipeta alargada, transfira um olho do disco de 35 milímetros para o disco de 60 milímetros sob um microscópio estereoscópico em alta potência. Utilize pinças finas para remover qualquer tecido, como músculos extraoculares e gordura, da superfície do olho.

Em seguida, remova o nervo óptico pinçando-o na base. Para isolar a retina, faça um pequeno orifício na esclera na região do limbo, onde a esclera e o epitélio pigmentado da retina aparecem brilhantes em comparação com o tecido retiniano, que é cinza fosco. Insira uma ponta de cada par de pinças no orifício e rasgue suavemente a esclera e o EPR.

Certifique-se de deixar a lente no lugar. Use a pipeta alargada para transferir a retina dissecada para o segundo recipiente de 35 milímetros contendo meio. Colete todas as retinas e armazene-as em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Até a eletroporação, trabalhando em uma câmara de cultura de tecidos para cada DNA Eloqua a ser eletroporado, preencha um prato estéril de 35 milímetros com meio de dissecação e um segundo prato com meio de cultura. Usando uma pipeta P200, lave as câmaras no prato de eletroporação com 1× PBS estéril 3 vezes. Preencha as câmaras com alíquotas de DNA de 60 microlitros e preencha quaisquer câmaras não utilizadas com 60 microlitros de 1× PBS.

Conecte os eletrodos ao recipiente de eletroporação e insira as configurações apropriadas no eletroporador. Use pinças finas para segurar as retinas pela lente e transferi-las para as câmaras de eletroporação. Coloque até quatro retinas em cada câmara.

Posicione as retinas de modo que a lente encoste na barra metálica ligada ao eletrodo positivo. Limpe a pinça entre cada câmara para evitar contaminação cruzada de DNA de uma câmara para a outra. Após alinhar todas as retinas, pressione iniciar no eletroporador.

Devem se formar bolhas minúsculas na barra metálica ligada ao eletrodo negativo. Desconecte os eletrodos e desligue o eletro com pinças. Mova suavemente as retinas para longe das paredes da câmara.

Transfira as retinas das câmaras para as placas de 35 milímetros contendo meio de dissecação. Usando uma pipeta estéril de transferência, transfira as retinas do meio de dissecação para as placas de 35 milímetros contendo meio de cultura. Rotule os poços de uma placa de cultura estéril de seis poços e preencha cada poço com três mililitros de meio de cultura.

Use pinças estéreis para colocar suavemente filtros circulares Watman Nucleo sobre o meio em cada poço, com o lado brilhante dos filtros voltado para cima. Com auxílio de um microscópio estereoscópico, transfira uma única retina para o filtro usando uma pipeta de transferência com o lado da lente voltado para baixo. Se a retina cair com o lado da lente para cima, aspire-a novamente para dentro da pipeta e tente novamente.

Coloque não mais do que quatro retinas em cada poço e mantenha-as em gotas separadas. Depois que as retinas forem posicionadas nos poços, transfira a placa de cultura para um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e cultive pelo tempo desejado. Normalmente, após oito dias, observa-se aqui que os resultados bem-sucedidos de eletroporação resultam na expressão do construto de DNA em um quarto a um terço da superfície retiniana.

Os níveis de fluorescência são quantificados comparando regiões uniformemente eletroporadas que expressam o construto CRE com regiões fora da retina e, em seguida, normalizando em relação à expressão de GFP controle. Os fotorreceptores bastonetes, em particular, são eficientemente transduzidos, conforme mostrado. Abaixo estão os resultados de uma eletroporação na qual dois promotores específicos de bastonetes direcionam a expressão de GFP e DS red na camada nuclear externa.

Ao sobrepor os dois padrões de expressão com a coloração de DPI mostrada aqui em azul, a expressão específica dos fotorreceptores torna-se evidente. Nenhuma expressão é observada na camada intercalar nem na camada de células ganglionares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar, eletrizar e cultivar explantes retinianos de camundongo com o objetivo de quantificar a atividade de elementos reguladores de cistos retinianos.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.