Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por

Jane transferiu-se para o ouvido interno de camundongo em desenvolvimento por eletroporação in vivo Ling Wang, Han Jang e John Burgandy, Centro de Pesquisa em Audiologia, Universidade de Ciências da Saúde do Oregon. Ok. Meu nome é John Burgandy. Meu laboratório está no Centro de Pesquisa em Audiologia da Universidade de Ciências da Saúde do Oregon.

Meu nome é Ang. Sou pesquisador no laboratório de John. Também sou Ang no laboratório de John como assistente de pesquisa.

Nossa apresentação é dividida em quatro partes. A primeira é a laparotomia ventral. Demonstramos o uso da pentobarbital sódica como anestesia, como testar a adequação da anestesia, a proteção da córnea, o preparo do local cirúrgico, a desinfecção, a ficha de dados de cirurgia sobrevivente em camundongos, o conjunto cirúrgico, a incisão mediana ventral através da pele e da parede abdominal e a exteriorização dos cornos uterinos.

A segunda parte é a microinjeção transuterina. Demonstramos a transiluminação do embrião, reorientação do embrião, microinjeção, fabricação de pipetas e microinjeção no Otis no dia embrionário 11,5 e no dia embrionário 12,5. A terceira parte é a eletroporação in vivo.

Demonstramos a colocação do eletrodo no estilo de pá e a eletroporação do ouvido interno do camundongo no dia embrionário 11,5. A parte quatro apresenta resultados representativos. Mostramos a expressão de GFP em cócleas embrionárias tardias e pós-natais precoces.

Isso resultou da eletroporação in vivo do Otis com plasmídeo de expressão no dia embrionário 11,5, parte um, laparotomia ventral. A fêmea é segurada firmemente pela pele atrás do pescoço, pela cauda e pela pata traseira esquerda. Uma injeção intraperitoneal de anestésico à base de pentobarbital de sódio é administrada após limpeza do abdômen com etanol 70%.

O camundongo é colocado dentro da sua gaiola de origem por quatro a cinco minutos para permitir que o anestésico aja. Compressões nos pés e na cauda são utilizadas para avaliar a adequação da anestesia. Esta fêmea reage à compressão da cauda e precisa de mais dois minutos antes de tornar-se irresponsiva a estímulos nocivos.

Unguento oftálmico estéril é aplicado nos olhos para proteger as córneas da dessecação. Preparamos o local cirúrgico em uma capela de exaustão química para minimizar a dispersão de pelos e caspa. Os pelos são raspados com uma lâmina fina para expor a pele que recobre a parede abdominal.

A remoção completa do pelo facilita a cicatrização da incisão no pós-operatório. A desinfecção da pele abdominal é realizada por meio de passagens alternadas de etanol 70%, Betadine e etanol 70%. Sempre realize o movimento de rostral para caudal e utilize uma bola de algodão cirúrgica ou aplicador com ponta de algodão novo.

Para cada passagem, avaliamos a profundidade e a qualidade das respirações durante a desinfecção para garantir que a camundonga esteja inconsciente. Após a segunda passagem com etanol 70%, colocamos imediatamente a superfície ventral da camundonga para baixo sobre um campo estéril e a posicionamos sobre uma placa aquecida por dois a três minutos para aquecê-la. Este é um momento conveniente para registrar os dados pré-operatórios na ficha de cirurgia sobrevivência em camundongos. Anexamos nossa ficha de dados de cirurgia sobrevivência em camundongos como informação suplementar.

Considere incluir a ficha de dados e o seu protocolo de cuidados com animais para que o comitê institucional de cuidados e uso de animais possa verificar como você monitorará os dados pré-operatórios, operatórios e pós-operatórios. Completamos uma ficha de registro para cada animal submetido à cirurgia. Preferimos realizar a cirurgia em um ambiente estéril, embora isso geralmente não seja necessário para roedores.

A superfície de trabalho é separada do motor do ventilador e da carcaça da câmara de pressão, de modo que nenhuma vibração é transmitida ao usuário. Durante a microinjeção, incluímos como informação suplementar um esquema das modificações que realizamos em nossa cabine de fluxo laminar para facilitar a transferência gênica in utero; as alterações essenciais são recortes de baixa altura para desafio e iluminação embutida, tomadas ocultas para os cabos de alimentação dos instrumentos e um trajeto para roteamento de circuitos elétricos auxiliares. A sala cirúrgica é composta por bolsa de soro fisiológico com lactato, aquecida eletricamente, banho morno, manipulador XY, Z, microscópio estereoscópico com fluorescência, microscópio de dissecação, fonte de luz de fibra óptica e instrumentos cirúrgicos.

Os pedais são usados para acionar o microinjetor, o eletro píer enter foco. Os instrumentos cirúrgicos do microscópio são esterilizados em uma autoclave. Os instrumentos devem ser reesterilizados entre camundongos usando um esterilizador de contas de vidro ou reesterilizando o porta-agulhas na autoclave.

As tesouras com pontas esféricas, pinças anelares e pinças vasculares são os instrumentos essenciais. Faça uma incisão na linha média ventral, segure a pele com a pinça vascular e remova o tegumento com a tesoura de ponta esférica, estendendo a incisão de 10 a 14 milímetros. Identifique a faixa branca avascular de tecido conectivo chamada linha alba e, na linha média ventral do abdômen, faça uma incisão na linha alba com a tesoura de ponta esférica.

Tendo cuidado para não lesar o intestino ou os tecidos adiposos inguinais. Imediatamente, irrigue a cavidade abdominal com solução de Ringer lactato estéril pré-aquecida. Avalie os locais de incisão na pele e na parede abdominal quanto a sangramento.

A pressão direta com pinças rombas interromperá sangramento leve, se presente, e exteriorizará os cornos uterinos direito e esquerdo com pinças de ponta anelar. Capture suavemente o corno uterino direito com uma das extremidades aneladas da pinça e puxe o útero em direção à incisão mediana. Use a mão livre para manipular suavemente o lado lateral da fêmea a fim de facilitar a fixação do útero.

As pinças nunca são usadas para comprimir o útero e puxá-lo para fora. Isso poderia danificar a vasculatura uterina ou os embriões. Repita o procedimento de exteriorização para o cornete uterino esquerdo. Imediatamente, irrigue os cornetes uterinos recém-exteriorizados com solução de Ringer lactato pré-aquecida, e reinsira suavemente as gorduras peritoneais ou os intestinos, caso eles se exteriorizem junto com o útero.

Isso não é encontrado com frequência. Injeção microuterina, parte dois. A fêmea é posicionada abaixo do objetivo de longa distância de trabalho e uma luz de fibra óptica com cabo flexível é colocada contra a parede uterina.

O útero é suavemente pressionado com um dedo da mão livre. Para facilitar a identificação da orientação do embrião. A luz do cabo de fibra óptica deve estar na menor intensidade necessária para avaliar com precisão a orientação do embrião.

Luz intensa pode transmitir calor ao útero, o que pode causar complicações. Seguramos a luz de fibra óptica e o útero com uma mão e usamos um dedo da mão livre para reposicionar o embrião por palpação suave. Demonstramos nos seguintes três vídeos por microscopia EC clipes e as orientações embrionárias comuns observadas no útero.

O espectador verá a imagem microscópica que observamos durante a transiluminação, embora em preto e branco, a transiluminação do útero permita a detecção da orientação do embrião in vivo. Neste exemplo, o embrião está em posição de cabeça para baixo, com sua superfície ventral voltada para o espectador. Ao alternar o útero para frente e para trás, podemos identificar os membros posteriores direito e esquerdo, a cauda e o olho esquerdo do cefalópode.

Neste exemplo, o embrião está novamente na posição de cabeça para baixo, mas girado cerca de 90 graus em relação ao eixo anterior-posterior. Ao alternar suavemente o útero para frente e para trás, podemos observar as formas em formato de pá que definem a pata traseira esquerda e a pata dianteira esquerda. O cérebro posterior também é evidente.

O embrião está em uma posição ereta, com seu lado esquerdo voltado para o observador. O quarto ventrículo em formação é detectável como uma mancha brilhante no cérebro posterior. O cefálico do olho esquerdo, o membro anterior esquerdo e os membros posteriores esquerdos também são evidentes.

Uma pressão suave sobre o útero realinha ligeiramente os embriões, permitindo a detecção do tronco principal da veia cefálica primária e de seus ramos anterior e posterior, que são marcados com asterisco branco e preto, respectivamente. Como veremos, o Otis está localizado na metade da distância entre os ramos anterior e posterior da veia cefálica primária. O próprio Otis não pode ser visto através do útero por transiluminação.

Mostramos em dois clipes consecutivos de microscopia por vídeo como reposicionar o embrião para a microinjeção com o auxílio do Otis. O objetivo é identificar as referências embriológicas que permitem a interpolação da localização do Otis na região lateral da cabeça. Mesen con, nosso objetivo é reposicionar o embrião da posição dorsal para a lateral, para que possamos identificar a veia cefálica primária.

O mesencéfalo, o quarto ventrículo e a extremidade esquerda são evidentes na posição dorsal. Uma pressão suave sobre o útero altera a orientação do embrião de dorsal para lateral. O olho esquerdo, o cefalono, o mesencéfalo e o quarto ventrículo são prontamente aparentes.

A veia cefálica primária e seu ramo posterior indicados pelo asterisco também são evidentes. O ramo anterior da veia cefálica primária não é claramente detectado. Nosso objetivo, novamente, é orientar o embrião para que consiga identificar a veia cefálica primária, mas com maior aumento apropriado para microinjeção uterina.

Os vasos uterinos, a faixa decidual e o olho esquerdo são vistos nesta perspectiva lateral. Uma pressão suave sobre o útero altera a posição do embrião, permitindo-nos detectar o quarto ventrículo e o olho esquerdo. A veia cefálica primária e seu ramo posterior, indicados pelo asterisco, fazem com que a veia cefálica primária e seus ramos assumam a forma dos postes de futebol americano.

A vesícula ótica não pode ser vista através do útero, mas está localizada no centro das estruturas verticais. Lynn iniciou uma sequência de injeção para um embrião. Ela transilumina o útero, reorienta o embrião para uma microinjeção e introduz no campo visual a pipeta de microinjeção preenchida com verde rápido.

A pipeta de microinjeção é fixada a um suporte de pipeta que é segurado por um micromanipulador X, Y, Z. O suporte magnético do micromanipulador é fixado a uma placa de aço com base de teflon que permite posicionamento grosseiro fácil da pipeta de microinjeção. A agulha é avançada utilizando o botão de controle micrométrico frontal no micromanipulador apropriadamente.

As pipetas fabricadas são essenciais para uma microinjeção pouco traumática no embrião de camundongo em estágio inicial de Otis. Puxamos tubos capilares de vidro borossilicato de parede grossa com um puxador de pipetas horizontal. A pipeta resultante mostrada em A é quebrada manualmente com pinça na posição de diâmetro externo de aproximadamente 14 a 16 mícrons indicada pela seta em B. A quebra irregular da pipeta mostrada em C é irregular e frágil.

Nós afilamos a pipeta em aproximadamente 20 graus para aguçar a ponta da pipeta, conforme visto no painel D; os parâmetros para puxar e afilar pipetas de microinjeção são fornecidos no texto acompanhante. Demonstramos nos dois próximos clipes de microscopia em vídeo a microinjeção no ouvido otico de camundongo nos dias embrionários 11,5 e 12,5. Nosso objetivo é demonstrar a microinjeção uterina no ouvido otico de camundongo no dia embrionário 11,5.

Primeiro, injetamos os embriões na ausência do útero para mostrar de forma inequívoca como se apresenta uma injeção corretamente direcionada. Em seguida, demonstramos uma autêntica microinjeção transuterina. Nesta primeira injeção, o útero foi incisado completamente para permitir que o saco visceral se extrudisse; a faixa deciduária que recobria o saco vitelino visceral foi removida.

A placenta permanece ligada ao útero e o embrião está vivo. Com a remoção focal do útero, observamos o quarto ventrículo, a veia cefálica primária e seus ramos anterior e posterior, a pipeta e a localização aproximada do cisto em branco. No início desta sequência de injeção, é detectado fluxo sanguíneo na vasculatura do saco vitelino visceral.

A pipeta é avançada através do saco vitelino visceral e o dai é injetado no osis note, no ducto linfático endolinfático dorsalmente e na posição dos otic nos centros dos montantes. Os otic estão a meia distância entre os ramos anterior e posterior da veia cefálica primária; a microinjeção uterina no dia embrionário 11,5 dos otic de camundongo exige a detecção da veia cefálica primária e de pelo menos um de seus ramos para estimar a localização do otic assist.

Nosso objetivo neste exemplo esquemático é detectar tanto o ramo anterior quanto o posterior da veia cefálica primária, com o território da OUC marcado em branco. Uma representação mais realista do embrião é aquela em que o tronco principal da veia cefálica primária é detectado juntamente com apenas um de seus ramos; no exemplo apresentado, observa-se somente o ramo posterior da veia cefálica primária, mas isso é suficiente para interpretar a localização das oticas. O PT é avançado através do útero e o corante é injetado nas oticas.

Esperamos 30 segundos para permitir que o corante seja eliminado da cavidade amniótica, momento em que podemos visualizar dorsalmente o ducto endolinfático e o vestíbulo. Concluímos com uma visão em baixa ampliação do embrião cujo cisto acabamos de injetar, fornecendo perspectiva anatômica; nesta visão, observam-se o quarto ventrículo, o olho esquerdo e a vasculatura uterina. Demonstramos a trans e microinjeção no cisto otico de camundongo no dia embrionário 12 e a microinjeção no quarto ventrículo em formação do cérebro posterior.

A transiluminação permite detectar a veia cefálica principal nesta visão lateral esquerda, bem como o olho. A pipeta é avançada através do útero até a vesícula ótica e o corante é injetado para preencher seu lúmen. Para injetar o quarto ventrículo, rotacionamos o embrião 90 graus para obter uma visão dorsal do cérebro posterior.

O cisto injetado esquerdo está agora no lado esquerdo. A pipeta é avançada através do útero e o verde rápido é misturado com lor. A dextrana conjugada é injetada no quarto ventrículo.

Observe que o volume de corante injetado não penetra no mesencéfalo in vivo. A fluorescência é avaliada após a injeção para validar a localização do dextrano no quarto ventrículo. Em seguida, o embrião é reposicionado da posição dorsal para a lateral.

O ducto linfático endolinfático está logo ventral ao quarto ventrículo nesta visão lateral. A fluorescência in vivo valida a localização do dextrano no quarto ventrículo. Ao nascer, examinamos as crias em busca de fluorescência verde no quarto ventrículo utilizando uma fluorescência epi.

Com um microscópio estereoscópico, filhotes com fluorescência verde em seus cérebros posteriores possuem uma orelha interna que foi manipulada durante a embriogênese, parte três, eletroporação in vivo. Após preencher o cisto com plasmídeo de expressão, o útero é recém-irrigado com solução de Ringer lactato pré-aquecida. A transiluminação facilita o posicionamento central do cisto ODU no campo eletrodo.

A cabeça metálica da luz de fibra óptica é retratada da superfície uterina. Antes de iniciar a sequência de pulsos em onda quadrada, demonstramos no próximo clipe de microscopia em vídeo um ciclo completo de eletroporação in vivo. A eletroporação do cisto otico de camundongo no dia embrionário 11,5 exige o posicionamento suave dos eletrodos do tipo pás sobre o útero.

Neste exemplo, o cisto ótico esquerdo foi preenchido com plasmídeo de expressão e o útero foi recentemente irrigado com solução de Ringer lactato. O cátodo é posicionado lateralmente em relação ao cisto ótico preenchido e o ânodo é posicionado medialmente no início da sequência de estimulação, com o cisto ótico centralizado no campo da palheta. O útero é suavemente comprimido e a série de pulsos em onda quadrada é iniciada com um interruptor de pedal.

Idealmente, de 60 a cem miliampères de corrente são entregues por pulso. O útero é então liberado e imediatamente irrigado. O útero recém-irrigado é retornado à cavidade abdominal por meio de pressão suave com a pinça de anel.

Uma vez que o útero é internalizado, a cavidade abdominal é lavada com cerca de quatro mililitros de solução de Ringer com lactato, deixando cerca de um mililitro de solução de Ringer com lactato na cavidade abdominal para ajudar a manter a hidratação da fêmea, que beberá menos água do que o habitual imediatamente após a cirurgia abdominal. A parede abdominal e, em seguida, a pele são fechadas com sutura reabsorvível utilizando um porta-agulhas. Nosso porta-agulhas possui uma tesoura embutida que simplifica o fechamento.

Preferimos um ponto contínuo tanto para a parede abdominal quanto para a pele. Fazemos o bloqueio a cada dois pontos para fornecer suporte adicional no local da incisão. Administraremos um medicamento anti-inflamatório não esteroide por via subcutânea antes de colocar o animal na gaiola de recuperação.

Consulte sua equipe veterinária sobre quais analgésicos profiláticos são preferidos pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais. A matriz é acomodada em um campo cirúrgico estéril e colocada no piso da gaiola de recuperação aquecida. A gaiola de recuperação contém material para ninho, um tubo vermelho para abrigo, ração laboratorial e uma garrafa de água.

A gaiola é remontada com um boné filtrante na parte superior na manhã seguinte à cirurgia. A fêmea está bem cuidada, ambulatória e capaz de se equilibrar sobre os membros posteriores para investigar a tampa aberta da gaiola. A linha de sutura no abdômen está limpa, seca e não apresenta sinais de deiscência, vermelhidão ou inchaço.

Acrescentamos um documento que discute o desenvolvimento de protocolos de cuidados com animais para transferência gênica in utero. O documento contém termos que podem ser úteis ao elaborar um protocolo específico da instituição em consulta com o comitê de cuidados e uso de animais. Parte quatro, resultados representativos.

Os painéis de resultados representativos A e B mostram uma cóclea representativa de um filhote no sexto dia pós-natal cujo Otis foi injetado com um plasmídeo de expressão de proteína verde fluorescente aprimorada no dia 11,5 do desenvolvimento embrionário e, em seguida, eletroporado. A parede lateral da cóclea foi removida da região média e do ápice. Apenas a expressão de GFP está presente desde a base até a região média da cóclea e segue a distribuição do marcador de células ciliadas miosina sete A mostrado no painel B. O painel C mostra uma projeção confocal de baixa ampliação do dia embrionário.

18,5 órgãos auditivos de camundongo imunomarcados com um anticorpo contra miosina sete A apresentam células transfectadas distribuídas por todo o órgão auditivo. O painel D mostra uma projeção confocal de alta ampliação do dia embrionário. 18,5 órgão auditivo de camundongo corado com cin.sete.

A expressão de GFP é detectada em células ciliadas internas e externas, células interfalangianas, células pilares e células TER. A transferência gênica mediada por eletroporação para o otide no dia embrionário 11,5 transfecta progenitores que dão origem a todos os tipos celulares componentes do órgão de Corti.