ReAsH / Flash Rotulagem e Análise de Imagem Sensor de Proteínas em Células Tetracysteine

O objetivo geral deste procedimento é rotular células que expressam uma proteína marcada com tetra-cisteína e fluorescente com os corantes flash ou ash, e analisar quantitativamente os resultados. Isso é realizado primeiramente transfectando um plasmídeo que carrega uma proteína fluorescente e a proteína alvo contendo uma marcação de tetra-cisteína na linhagem celular de interesse. Em seguida, a proteína expressa é rotulada com R ou flash, e o corante ligado de forma não específica é removido por lavagem com BAL para preparar a amostra para a imagem microscópica.

Em seguida, utiliza-se um microscópio confocal para coletar imagens fluorescentes das células nos canais do ash ou flash e da proteína fluorescente. Por fim, as imagens são analisadas usando o ImageJ para quantificar a ligação do ash ou flash à proteína-alvo. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram o grau de ligação do ash ou flash à proteína-alvo nas células por meio da correlação entre a fluorescência do ash e a fluorescência da proteína fluorescente.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como simplesmente marcar a proteína-alvo com GFP, é que ela permite acompanhar uma segunda propriedade da proteína, tal como mudança conformacional, além de sua localização. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da subestrutura e função proteica, tais como eventos de oligomerização, mudanças conformacionais e eventos de ligação de LI que alteram a capacidade do TAC de se ligar ou dissociar rapidamente. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejávamos avaliar como pequenos agregados submicroscópicos de huntingtina mutante se formam nas células.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a etapa de análise de dados é difícil de aprender por ser tecnicamente complexa. A demonstração dos procedimentos experimentais. As etapas um a três serão realizadas por Yasmin Ranson, assistente de pesquisa do nosso laboratório, demonstrando a análise de dados. A etapa quatro será realizada por Sevki GaN, estudante de pós-graduação do nosso laboratório, utilizando métodos padrão de cultura celular para a linhagem celular de interesse e uma lâmina para imagem de células vivas pronta para transfeção.

Prepare um cultivo de células aderentes e transfete seu plasmídeo contendo o gene de interesse com a marcação TC. De acordo com o método de transfeção escolhido, é importante incluir controles positivo e negativo para avaliar o grau de ligação específica às marcações TC, bem como verificar a vazão de fluorescência entre canais durante a aquisição de micrografias confocais. Portanto, para duas cores, certifique-se de que as amostras sejam preparadas com cores individuais, ou seja, a proteína fluorescente isoladamente e, se possível, uma proteína T ctech ligada à carne ou vs.

Mas sem uma proteína fluorescente. Um a dois dias após a transfeção, lave suavemente as células com 300 microlitros de solução salina balanceada de Hank pré-aquecida ou HBSS, prepare HBSS fresco pré-aquecido com 10 micromolar, um, dois, etanotiol ou EDTA e um micromolar flash ou ash. E após remover o HBSS das células, substitua cuidadosamente por 300 microlitros do meio ash e incube por exatamente 30 minutos a 37 graus Celsius em um incubador de cultura de tecidos.

Em nossa experiência, tempos de incubação mais longos aumentam significativamente a fluorescência de fundo. Aspire suavemente a solução de marcação das células e substitua por 300 microlitros de HBSS pré-aquecido com 250 micromolar, dois três dímero, cap propanol ou BAL por 15 minutos a 37 graus Celsius. Remova a solução de lavagem por aspiração suave e substitua por 300 microlitros de HBSS pré-aquecido.

Após esta lavagem, as células podem ser fixadas com paraformaldeído, embora tenhamos observado que isso aumenta a fluorescência inespecífica. Portanto, geralmente realizamos a imagem das células vivas à temperatura ambiente. Além disso, a fixação das células antes da marcação impede a ligação do corante bial.

Para iniciar a aquisição de imagens de células no microscópio confocal, configure os parâmetros para a aquisição das imagens dos fluoróforos individuais e certifique-se de que haja vazamento desprezível entre os canais. Em seguida, ajuste as configurações do fotomultiplicador para que a fluorescência máxima na amostra não sature o detector. Uma vez determinadas as melhores configurações de aquisição, não altere nenhuma delas entre as amostras.

Utilize uma taxa de varredura de 200 hertz, colete quatro médias de linha e defina o diâmetro do pinhole como uma unidade de área. O diâmetro do pinhole pode ser ampliado se houver problemas com a relação sinal-ruído. No entanto, isso pode resultar em alguma perda de resolução de imagem.

Colete as imagens confocais em um formato de 12 bits ou superior, se possível. Para maximizar a qualidade da análise de dados quantitativos. Colete imagens para o canal da proteína fluorescente e também para o canal do corante BI arsenal para todas as amostras.

Para analisar os dados, utilize o software Image J com os seguintes plugins. Se estiver usando uma versão do Image J anterior à versão 1.32 C, clique nas seguintes opções. Para permitir que múltiplas imagens sejam abertas ao mesmo tempo, edite as opções de entrada barra saída, marque a caixa para usar o seletor de arquivos j para abrir barra compartilhar.

Clique em OK. Abra as imagens de interesse. O Image J definirá automaticamente as intensidades máximas e mínimas dos pixels que são exibidas na tela para cada imagem separadamente, porque diferentes imagens terão intensidades diferentes de pixels.

Isso significa que as imagens exibidas não são comparáveis conforme visualizadas. Para garantir que as imagens abertas estejam todas na mesma escala, defina fisicamente as intensidades de pixels superiores e inferiores a serem visualizadas. Para definir esses valores, escolha a imagem e ajuste o brilho/contraste.

Clique em definir, estabeleça os valores mínimos e máximos exibidos. Em seguida, escolha propagar para todas as imagens abertas e clique em ok. Alternativamente, posicione todas as imagens de um canal específico juntas em um único arquivo ou pilha.

O ImageJ ajustará automaticamente todas as imagens para a mesma escala. Para fazer isso, escolha pilhas de imagens, selecione as imagens para empilhar, insira um nome comum a cada arquivo e escolha usar os títulos como rótulos. Clique em OK.

Converta todas as imagens abertas para oito bits para análise. Ao escolher o tipo de imagem de oito bits, isso reescalará a faixa exibida para um intervalo de zero a 255. É importante não salvar sobre o formato original de 12 bits ou superior, pois isso resultará na perda de conteúdo de informação.

Salve uma cópia em uma nova pasta chamada oito bits convertido usando a opção salvar como. Um método para examinar o grau de ligação do corante bi arsal em uma imagem inteira é realizar um gráfico de correlação de intensidade de pixels. Este gráfico mostra cada valor de pixel em um canal em relação ao valor de pixel correspondente em um segundo canal.

Portanto, uma posição de pixel com alta fluorescência de GFP também apresentará alta fluorescência de cinzas se houver ligação elevada. Para analisar a co-correlação dos pixels, certifique-se de que as imagens de GFP e REA de oito bits estejam abertas no ImageJ. Em seguida, abra o plugin Image Correlator selecionando Plugins > Image Correlator. Atribua os arquivos de imagem à imagem um e à imagem dois.

Em seguida, clique em OK. A pilha resultante pode não exibir nenhuma informação detalhada. Isso é normal.

Salve a pilha em uma nova pasta chamada gráficos de dispersão e dê a ela o mesmo nome de arquivo da amostra a que se refere. Por exemplo, Gráfico de Correlação Ash GFP. Para visualizar os dados, escolha uma das duas opções.

Primeiro, transforme os dados para um formato logarítmico escolhendo o processo matemático log automático. Em seguida, para reescalar visualmente os dados, clique em imagem ajustar brilho/contraste e selecione automático. Segundo, reescalone visualmente os dados para mostrar apenas valores baixos e exiba os dados usando uma tabela de pesquisa especial ou LUT para criar uma LUT personalizada.

Clique no LUT de edição de cor da imagem para um LUT muito simples. Clique no pixel superior esquerdo e escolha a cor preta. Em seguida, selecione o próximo pixel à direita e escolha a cor vermelha.

Em seguida, clique no terceiro pixel e, mantendo o botão do mouse pressionado, arraste a seleção até o pixel inferior direito. Selecione a cor vermelha, clique em OK e depois selecione a cor branca e clique em OK. Selecione a faixa de brilho e contraste de zero a 255, conforme descrito anteriormente, para fixar a imagem àquela exibida na tela.

Converta para o formato RGB para copiar e colar imagens em outros programas. Primeiro, abra as imagens de oito ou 16 bits conforme descrito anteriormente. Atribua um esquema de cores LUT às imagens para GFP.

Atribua a LUT verde clicando na imagem. Consulte as tabelas verdes. Finalmente, selecione a imagem para copiar e copie-a para a área de transferência escolhendo editar copiar para o sistema. Esta figura mostra um resultado típico para a cinase sock fusionada, a GFP e uma marcação TC que foi corada por 30 minutos.

Com a ash em células HEC 2 9 3, parece que a ASH se liga eficientemente à proteína-alvo que carrega uma marcação TC com alta afinidade. Em contraste, esta figura mostra a amostra controle correspondente de SARK fundida à GFP, mas sem a marcação TC, o que é essencial para verificar tanto a especificidade da marcação TC quanto o nível de coloração de fundo. Este resultado mostra que a RH não apresenta reatividade com a proteína-alvo, que lack a marcação TC, o que indica a especificidade da marcação TC para a ligação com SSH.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não permitir que as células fiquem confluentes e calmas, pois isso afetará a ligação de V nas células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar quantitativamente seus dados de forma simples, e poderá aperfeiçoar esses métodos para desenvolver seu próprio IUTS exclusivo para visualização de dados.