Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo

Um dos desafios do estudo do desenvolvimento na neurociência é capturar as morfologias dendríticas e axônicas em nível de célula única in vivo. No sistema olfativo, os neurônios sensoriais olfativos estendem seus axônios do epitélio olfativo no nariz até o bulbo olfativo no cérebro. À medida que múltiplos neurônios sensoriais olfativos projetam-se em direção ao bulbo olfativo, eles se agrupam em feixes.

Isso complica o estudo das trajetórias individuais dos axônios e suas morfologias terminais. Desenvolvemos um método para visualizar neurônios sensoriais olfativos individuais in vivo por meio da microinjeção de um construto GFP associado a lentivírus.

A transdução bem-sucedida com lentivírus ilumina todo o comprimento do axônio sensorial olfativo, incluindo a arborização terminal. Além de permitir a visualização de neurônios sensoriais olfativos individuais, este método nos permite manipular a expressão gênica de um gene de interesse específico para estudar sua função em um contexto in vivo. Este procedimento com lentivírus requer nível de biossegurança dois e deve ser realizado em uma cabine de fluxo laminar.

Para manter um ambiente estéril, pulverize com etanol 70% tudo o que for inserido na cabine, prepare e pré-aqueça uma cama d'água a 37 °C por pelo menos 20 minutos antes da injeção. Sobre um bloco de aquecimento incubador vazio, coloque um saco plástico de armazenamento selado, preenchido pela metade com água.

Isso permitirá que os camundongos se recuperem após a injeção. Encha um recipiente de resíduos biológicos com água sanitária a 10% para descontaminar todos os materiais expostos ao vírus. A partir deste procedimento, prepare um pequeno recipiente aberto com etanol a 70% e um segundo recipiente com água destilada estéril.

Em uma cabine de fluxo laminar, utilizaremos uma seringa Hamilton com capacidade de cinco microlitros e agulha de calibre 33. Esse modelo específico permite ajustar a resistência do êmbolo girando um dial de tensão localizado na parte superior da câmara do êmbolo. Esse recurso proporciona controle do volume de microinjeção e esteriliza a agulha e a câmara da seringa.

Aspire e eja etanol repetidamente do recipiente várias vezes. Enxágue a cartela da seringa aspirando e ejetando água estéril várias vezes. Coloque a seringa em local seguro dentro da cabine de fluxo laminar.

Organize lenços umedecidos com álcool próximo à estação de injeção. Prepare uma plataforma de injeção que forneça uma superfície elevada, facilitando o posicionamento do camundongo. Pode-se usar uma placa de cultura de 10 centímetros invertida, coberta com lenços de papel Kim.

Filhotes de camundongo podem ser anestesiados por hipotermia até a idade de desmame. Corte um dedo de uma luva de borracha e coloque o filhote dentro do corte no formato de dedo. Em seguida, coloque sobre gelo por cinco minutos.

A luva evitará queimaduras na pele que ocorreriam pelo contato direto da pele com o gelo. Teste a anestesia completa beliscando as patas traseiras e dianteiras do filhote para garantir que o animal não responda. Agora estamos prontos para a microinjeção de lentivírus. Iremos demonstrar o procedimento com um filhote neonatal.

Se for utilizada uma idade mais avançada do camundongo, deve-se substituir a agulha de 33 graus por uma agulha de maior calibre para penetrar a superfície do crânio. Esterilize a superfície nasal do camundongo limpando-a com um disco de álcool. Retire os estoques de lentivírus do congelador e descongele em gelo.

Produzimos lentivírus em nosso laboratório utilizando métodos estabelecidos. Ao desenvolver este método, descobrimos que uma titulação viral mínima de 10 elevado à nona unidades infecciosas por mililitro é necessária para uma boa taxa de transdução. Aspire dois microlitros da solução estoque de lentivírus para a seringa esterilizada de Hamilton.

Coloque o filhote de camundongo sobre a plataforma de injeção. Segure a pele no topo da cabeça pelas orelhas e puxe suavemente para trás. Equipamos nosso fluxo laminar com um microscópio estereoscópico.

Para direcionar com precisão as microinjeções, examine a superfície dorsal do crânio na região do prosencéfalo em busca do contorno do bulbo olfatório. Nossos alvos de microinjeção envolvem de perto o bulbo olfatório, mas não devem incluir o próprio bulbo. Aplicamos quatro injeções no epitélio olfatório de cada filhote.

Essas posições representadas por pontos azuis requerem que a agulha seja inserida em um ângulo direcionado medialmente. As duas injeções adicionais representadas por pontos verdes são deslocadas, mais medial e anterior ao bulbo olfatório. Essas injeções podem ser feitas com ângulo oblíquo.

As sugestões de ângulos da agulha são feitas levando em consideração o posicionamento ventral do epitélio olfatório, que está principalmente situado abaixo do bulbo olfatório. Assim, o acesso perpendicular é restrito. Insira a agulha através do topo da cavidade nasal, cerca de três milímetros abaixo da superfície da pele.

Para alcançar o epitélio olfativo. Uma mão treinada deve sentir a diminuição da resistência ao atingir o espaço luminar da cavidade nasal. Esta área deve ser evitada.

Microinjetar 0,5 microlitros de solução estoque do vírus por posição. Novamente, escolhendo dois sítios por lado, tanto esquerdo quanto direito, totalizando quatro injeções de 0,5 microlitros. Cada camundongo requer dois microlitros de vírus por sessão de injeção.

Novamente, tenha cuidado para não injetar no bulbo olfatório qualquer solução viral residual ou sangue que possa escapar do local da injeção ou das aberturas nasais. Usando uma toalha umedecida com etanol, descarte as toalhas no recipiente com água sanitária diluída e coloque imediatamente o camundongo injetado na incubadora com leito d’água para recuperação. Descontamine a agulha e a seringa repetindo o procedimento de esterilização realizado durante a preparação. Os camundongos injetados podem ser devolvidos às suas gaiolas 30 minutos após a recuperação na incubadora com leito d’água.

Toda essa microinjeção pode ser repetida novamente após quatro horas. Se desejar aumentar o número de neurônios sensoriais olfativos que serão infectados, os neurônios sensoriais olfativos infectados podem ser visualizados ao longo de todo o comprimento da célula em apenas três dias. Os animais são sacrificados e perfundidos para observação no momento desejado.

Utilizando métodos padrão, a fim de visualizar as trajetórias de neurônios sensoriais olfativos transduzidos individualmente e os terminais axonais, dissecamos e seccionamos o bulbo olfativo em corte coronal com espessura de 60 mícrons. Assim, a seção conterá todas as camadas celulares do bulbo olfativo, incluindo feixes de axônios de neurônios sensoriais olfativos e terminais axonais, que fazem sinapse em estruturas glomerulares localizadas na superfície do bulbo, em preparação para a imunohistoquímica em flutuação. São produzidas seções seriadas do bulbo olfativo e coletivamente transferidas para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato.

Transfira as seções flutuantes para um frasco cônico de 50 mililitros. Após as seções sedimentarem no fundo do frasco, remova o salino tamponado com fosfato por aspiração. Tenha cuidado para não aspirar as seções.

Reponha suas seções com 10 mililitros de tampão fresco para remover qualquer fixador ou material de inclusão residual. Imediatamente, pipete esta suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, certificando-se de recolher todas as seções flutuantes, remova a solução de lavagem a vácuo e perfure as seções com uma solução de 0,3% de Triton X-100 em tampão salino fosfato, colocando em uma plataforma agitadora por 10 minutos. À temperatura ambiente, você poderá então prosseguir com um protocolo padrão de imunomarcação no mesmo tubo cônico, repetindo os passos de vácuo e agitação conforme necessário para este recipiente, mantendo um volume de 10 mililitros para as etapas de marcação e lavagem.

Aqui está uma lista de anticorpos que utilizamos para marcação dupla de neurônios sensoriais olfativos positivamente transduzidos e da população geral de neurônios sensoriais olfativos. Para uma penetração completa dos anticorpos nos cortes de 60 mícrons do bulbo olfativo, recomenda-se incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Os tempos de lavagem também devem ter duração mínima de 20 minutos cada.

Espalhe suavemente cada seção em uma lâmina de vidro com um pincel, montando cada lâmina com a solução de montagem flora contendo corante para cromatina. Esforce-se para eliminar todas as bolhas do meio de montagem. Monte suas seções em linhas para facilitar a etapa subsequente de triagem.

Analise essas camadas em seus seções de bulbo imunomarcadas em busca de fibras e terminações axônicas positivas para GFP. Utilizando um microscópio fluorescente, terminais nervosos positivamente infectados podem então ser visualizados por microscopia confocal. É útil calibrar o plano focal na sua área de interesse utilizando os canais DPI e proteína marcadora olfativa.

Esses resultados mostram uma única fibra axonal e terminal axonal de neurônio sensorial olfativo dentro do glomérulo, que é corado com proteína marcadora olfativa em vermelho e vlu dois em cinza. Os corpos celulares de neurônios sensoriais olfativos infectados e seus botões dendríticos também podem ser visualizados dentro do epitélio olfativo, caso este tecido tenha sido incluído nas etapas de dissecção e imuno-histoquímica. Olá, minha projeção confocal fornece uma morfologia altamente detalhada do trajeto de extensão axonal e da arborização terminal de um único neurônio sensorial olfativo. Pode-se observar o trajeto curvo da fibra axonal em direção ao seu alvo glomerular, bem como os detalhes do seu padrão de ramificação dentro do neuropilo glomerular.

O método de microinjeção com lentivírus permite a visualização de axônios individuais, as morfologias dos neurônios sensoriais olfativos e possibilita estudos que manipulam a expressão gênica; a transdução por lentivírus resulta na integração genômica estável dos construtos. O lentivírus não infecta trans-sinapticamente as células vizinhas. A visualização pode ser alcançada em apenas três dias e já foi confirmada por um período de pelo menos três meses, provavelmente persistindo por períodos ainda mais longos.

Os neurônios sensoriais olfativos não são facilmente infectados por infusão nasal de solução de lentivírus. Portanto, é necessária uma microinjeção através da superfície neste procedimento. Assim, esse é o nosso procedimento de microinjeção de lentivírus.

Espero que você tenha encontrado todas essas informações úteis para alcançar morfologias de células individuais em suas próprias pesquisas. Boa sorte.