Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar o aprisionamento óptico combinado à microscopia confocal de disco giratório para observar interações entre patógenos e hospedeiros em tempo real. Isso é conseguido primeiramente adicionando os patógenos de interesse a um lamínula com câmara. Em seguida, uma partícula é selecionada e capturada com o aprisionamento óptico.

Por fim, a partícula é direcionada à célula de interesse. Como visto aqui. O aprisionamento óptico pode ser um método eficaz para controlar duas partículas para a observação de interações intracelulares dinâmicas.

Este método pode responder perguntas importantes sobre as interações entre hospedeiro e patógeno nas áreas de doenças infecciosas e imunologia, incluindo qual é o efeito na fagocitose quando se obtém controle completo das relações espaciais entre células hospedeiras e patógenos, bem como se a ordem na qual os patógenos são internalizados por uma célula fagocítica afeta a maturação fagosomal. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois as condições de aprisionamento precisam ser otimizadas para diferentes tipos de células e de microesferas. A demonstração visual deste método é essencial, assim como o processo de montagem e integração de um disco giratório.

A confocalização com uma armadilha óptica é difícil de conceituar devido ao alinhamento preciso necessário para todos os componentes ópticos. Colete o patógeno de interesse. Por exemplo, aqui, 300 microlitros de Candida albicans cultivados durante a noite em caldo são removidos do cultivo e transfira os patógenos para um tubo de reação de 1,5 mililitro.

Em seguida, lave os patógenos três vezes a aproximadamente 1300 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente, aspirando o sobrenadante e mantendo o precipitado intocado a cada vez, ressuspendendo em PBS e sonificando. Após a terceira lavagem, ressuspenda o precipitado em 500 microlitros de PBS. A seguir, dissolva um miligrama do corante de sua escolha em 100 microlitros de dimetilformamida para obter uma concentração final de 10 miligramas por mililitro.

Em seguida, adicione três microlitros da mistura de corante ao tubo de reação contendo os patógenos lavados. Envolva os tubos com papel alumínio, pois os corantes são sensíveis à luz, e agite a amostra a 37 graus Celsius por uma hora; depois, centrifugue e lave a amostra em PBS 3 vezes como anteriormente. Re-suspenda o pellet em 300 microlitros de PBS após a última lavagem.

aqueça o meio e o PBS a 37 graus Celsius em banho-maria. Lave uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros revestida com macrófagos RAW 264.7 duas vezes com PBS, aspirando o PBS entre cada lavagem. Em seguida, cubra a superfície da placa com cinco mililitros de tripsina e incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, bata suavemente na lateral da placa para destacar as células da superfície da placa. Tenha cuidado para não derramar a tripsina para fora da placa. Agora, adicione cinco mililitros de meio à placa e transfira a mistura para um tubo de reação.

Após a centrifugação, remova o meio aspirando com cuidado para não perturbar o pellet e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio. Adicione 400 microlitros de meio a cada câmara de uma lâmina com câmaras, e então adicione cinco microlitros da suspensão celular a cada câmara. Incube as células durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO₂.

Retire o lâmina com câmara do incubador e pipete de cinco a dez microlitros dos patógenos previamente preparados e marcados com fluorescência em cada câmara contendo macrófagos. Misture bem os macrófagos e os patógenos pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para não tocar o fundo da câmara e perturbar os macrófagos aderidos. Ligue todos os componentes do microscópio confocal de disco giratório.

Prepare o microscópio adicionando óleo à lente de imersão em óleo. Insira a lâmina com câmara no estágio especializado e, em seguida, remova a tampa da lâmina com câmara, alinhando o microscópio para imageamento DIC. Ligue o obturador para a armadilha óptica e o laser de infravermelho.

Em seguida, abra o obturador do laser para o armadilhamento óptico. Confirme que o obturador diante do laser de infravermelho está fechado, verificando com o cartão de infravermelho. Agora, foque nos macrófagos no lâmina aderida.

Em seguida, localize os patógenos livremente flutuando na solução adjacente aos macrófagos. A parte mais difícil deste procedimento é encontrar o objeto adequado para rastrear na câmara de amostra devido às forças de adesão entre o objeto e o lamínula na câmara de amostra. Para mover esse objeto, é necessário mover a platina enquanto o objeto é mantido pelo laser de aprisionamento, e também é importante observar que a platina deve ser movida lentamente o suficiente para que a força de arraste da platina não exceda a força máxima de aprisionamento da armadilha.

Mova a platina de modo que o patógeno fique nas proximidades da armadilha. Em seguida, abra o obturador e ative a armadilha. Mova a amostra para colocar os macrófagos em contato com uma imagem do patógeno aprisionado estacionário.

Os patógenos foram visualizados com um microscópio confocal de disco giratório em contraste de interferência diferencial (DIC), fluorescência ou uma combinação de ambos, separando populações de Candida albicans, que normalmente possuem cerca de cinco mícrons de tamanho, marcadas em verde, azul e vermelho. Para ilustrar a imagem, uma única C. albicans foi aprisionada e movida em um padrão quadrado através de um aglomerado de outras leveduras, conforme indicado pelas setas cinzas, demonstrando a capacidade de capturar e manipular a localização específica de um único patógeno escolhido pelo operador, mesmo em um ambiente denso. Para ilustrar ainda mais a flexibilidade deste sistema em aprisionar as diferentes morfologias de forma exibidas por organismos patogênicos nesta figura, a pinça óptica foi utilizada para segurar e posicionar uma partícula de C. albicans com uma pseudohifa.

O C albicans é marcado com corante vermelho e movido ao longo de uma trajetória conforme delineado pela seta branca, sendo colocado ao lado de células brutas GFPL C3 fluorescentes. Em verde. A porção leveduriforme do albicans foi aprisionada enquanto o pseudohifas se estendia.

Aspergillus fum goddess também foi posicionado ao lado de uma célula de macrófago de camundongo bruto para analisar o período absoluto de fagocitose com essa linhagem celular e patógeno específicos. Nesta figura, imagens de campo claro mostram como o aspergillus aprisionado, indicado pela seta branca, foi movido e posicionado ao longo do caminho indicado pela seta vermelha. O patógeno aprisionado está ligeiramente desfocado devido à armadilha empurrar o organismo ligeiramente acima do plano focal.

Aspergillus foi movido até ser colocado adjacente à célula bruta desejada. Assim que o patógeno entrou em contato com a célula, a armadilha foi desativada. O processo de fagocitose foi ativado e a microscopia com intervalo de tempo foi empregada para observar os eventos celulares subsequentes.

Em 30 segundos, a membrana da célula bruta começou a mudar e a formar uma cúpula ao redor da partícula. Em 60 segundos, a cúpula estava completamente formada. De 90 a 150 segundos, o Afu Gotti foi sendo englobado, e em 180 segundos a partícula estava totalmente internalizada.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um aparato de armadilha óptica com disco giratório e como tal instrumento pode permitir o controle não invasivo de patógenos para imagem em tempo real de células vivas após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de interações entre hospedeiro e patógeno investigarem o papel das relações espaciais entre células hospedeiras e patógenos, e seu papel na resposta imune subsequente.