Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar o cultivo conjunto de longo prazo de Hemófilo influenza não tipável ou NTHI com tecidos epiteliais respiratórios humanos primários utilizando o modelo epi airway. Isso é conseguido inoculando a superfície apical com NTHI para permitir que as bactérias adiram e entrem nos tecidos como segundo passo. Os inserts são lavados a cada 24 horas com DPBS pré-aquecido para simular o fluxo normal de muco e remover produtos residuais de mucina e quaisquer detritos celulares.

Em seguida, os tecidos são coletados no ponto temporal desejado e a sobrevivência das células totalmente associadas ou internalizadas de NTHI é determinada. Por fim, com este método, características específicas de cepas de sobrevivência de NTHI nos tecidos ao longo do tempo, com base na contagem de bactérias viáveis, podem ser avaliadas. Embora este método possa fornecer informações sobre infecções de longa duração com Haemophilus influenzae não tipável.

Ele também pode ser utilizado no estudo de outros patógenos humanos, como Moraxella Alis. Quem demonstrará este procedimento será a Dra. Doin Ran, pesquisadora pós-doutoranda em meu laboratório. Retire a placa de transporte da embalagem e prepare-se para iniciar o experimento. Pulverize a placa de transporte com etanol a 70% e coloque a placa dentro da cabine de segurança biológica.

Aliquote um mililitro do meio de manutenção de vias aéreas epi a quatro graus Celsius em cada poço de uma placa de seis poços. Em seguida, após remover a fita, abra a placa e remova a gaze que cobre os insertos de vias aéreas epi. Usando um movimento de torção, utilize pinças para soltar um inserto dos aros.

Coloque o inserto em uma das cavidades da placa de seis poços, se necessário. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente os aros do inserto, evitando tocar a membrana. Confirme que não há bolhas de ar aprisionadas sob os insertos.

Em seguida, coloque a placa de seis poços em uma estufa. Lave os inserts diariamente da seguinte forma: aqueça previamente o DPBS com cálcio e magnésio e encha uma ponteira com o DPBS. Em seguida, utilizando pinças estéreis, pegue suavemente um insert e pipete 200 microlitros do DPBS pré-aquecido sobre o tecido.

Em seguida, agite suavemente o inserto para distribuir uniformemente o DPBS sem tocar o tecido. A seguir, incline o inserto em um ângulo e posicione a ponteira de uma pipeta P1000 contra o anel de plástico que sustenta a membrana na parte inferior do inserto. Então, aspire cuidadosamente a solução tampão e transfira a solução para um tubo criogênico para estudo posterior.

Por fim, aspire o meio de manutenção basal e substitua-o por um mililitro de meio fresco. Pré-aqueça mais DPBS com cálcio e magnésio. Adicione três mililitros do DPBS pré-aquecido a um tubo de 15 mililitros e, em seguida, re-suspenda colônias isoladas de influenza não tipável ou NTHI cultivadas durante a noite em ágar chocolate no tubo.

Agora, agite o tubo vigorosamente em vórtex por pelo menos 10 segundos e, em seguida, meça a densidade óptica. Continue adicionando colônias individuais do NTHI até que a concentração bacteriana atinja uma OD em 600 nanômetros de aproximadamente 0,7. Em seguida, lave cada inserto de via aérea EPI com DPBS pré-aquecido como antes e, então, adicione 28 microlitros da suspensão bacteriana à superfície apical de cada inserto.

Evite inocular o meio de manutenção basal. Em seguida, retorne a placa ao incubador para quantificar o NTHI, primeiro pré-aquecendo e depois secando superficialmente as placas de ágar chocolate. A seguir, dilua em série o inóculo de NTHI utilizando PBS estéril com 0,1% de gelatina ou PBSG.

Coloque alíquotas de 10 microlitros do inóculo sobre as placas e, em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, determine as UFC por mililitro contando a diluição que apresentar de 15 a 30 colônias distintas em cada gota e calcule o valor correspondente ao inóculo viável real de NTHI para colher as bactérias associadas totais às células. Enxágue a superfície apical dos epi-airways três vezes com 200 microlitros de DPBS sem cálcio ou magnésio.

Em seguida, incline o inserto e enxágue todo o meio de manutenção remanescente da membrana basal. Coloque o inserto lavado em uma nova placa de seis poços e adicione 250 microlitros de solução estéril de 1% de saponina na superfície apical de cada tecido. Retorne a placa ao incubador por 10 minutos enquanto a placa estiver em incubação.

Prepare tubos para diluição em série, preenchendo cada tubo de diluição com 900 microlitros de PBSG. Em seguida, esfregue o tecido da membrana com uma ponteira de pipeta P 1000 usando um movimento de vai e vem, seguido por um movimento circular para remover o tecido das bordas do inserto. Depois, utilizando uma ponteira estéril de grande orifício de pipeta P 1000, transfira a suspensão para um tubo einor estéril de 1,5 mililitro vazio.

Agora, adicione 250 microlitros de DPBS na superfície apical do inserto e, em seguida, examine o inserto utilizando um microscópio invertido de contraste de fase para determinar se algum tecido ainda permanece para ser colhido. Adicione a suspensão ao tubo einor e complete com 500 microlitros de DPBS de forma vigorosa. Vortexe a suspensão celular por um minuto.

Em seguida, utilizando uma seringa estéril de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26. Aspire a suspensão para dentro da seringa através da agulha. Passe lentamente a suspensão através da agulha três vezes, tomando cuidado para não formar bolhas.

Em seguida, agite vigorosamente a suspensão em vórtex por mais um minuto. Depois, use uma ponteira de pipeta de grande diâmetro para transferir 100 microlitros da suspensão para o primeiro tubo de diluição. Agite o tubo vigorosamente em vórtex por cinco segundos e, em seguida, faça uma diluição seriada de um para 10, aplicando a diluição em placas de ágar chocolate.

Em seguida, incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono para contagens bacterianas viáveis e colher as bactérias internalizadas. Lavar cada inserto apenas três vezes com 200 microlitros de DPBS. Substituir o meio de manutenção basal por meio contendo 100 microgramas por mililitro de sulfato de gentamicina e, em seguida, adicionar 300 microlitros do meio de manutenção contendo gentamicina à superfície apical.

Retorne os inserts ao incubador por uma hora; enquanto os inserts estiverem em incubação, pré-aqueça um pouco de DPBS. Em seguida, remova o meio de manutenção contendo Gentamicina da superfície apical. Depois, lave extensivamente a superfície apical e a membrana basal dos inserts com o DPBS pré-aquecido.

Por fim, repita o procedimento de escovação e coleta recém-demonstrado antes de realizar diluições seriadas e o plaqueamento das bactérias internalizadas nesta figura. Comparando imagens de microscopia eletrônica de varredura de tecidos de vias aéreas epi não infectados à esquerda com tecidos de vias aéreas epi infectados com NTHI por cinco dias à direita. Pode-se observar que o cocultivo de longo prazo com NTHI não resulta em danos significativos aos tecidos apicais, destacando a utilidade do modelo de vias aéreas epi.

Aqui é apresentado um gráfico que mostra o número de NTHI internalizados ao longo do tempo durante uma co-cultura de via aérea epi. A cepa R 2 8 6 6 foi inoculada em aproximadamente uma vez 10 à sétima UFC por inserto. Em seguida, as bactérias internalizadas foram colhidas e enumeradas em cada ponto de tempo indicado.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o co-cultivo de longo prazo de NTHI com tecidos respiratórios hormonais primários utilizando um modelo PREA.