Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica
13 de novembro de 2011
O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.
O objetivo geral deste procedimento é coletar RNA total de núcleos cerebrais discretos de maneira repetível, consistente, economicamente eficiente e livre de RNAses. Isso é realizado primeiramente preparando um ambiente de trabalho livre de RNAses e removendo o cérebro inteiro de um camundongo decapitado. Em seguida, um cortador de tecidos operado por micrômetro é usado para cortar secções teciduais seriadas de tamanho uniforme.
Em seguida, regiões cerebrais de interesse são microdissecadas usando um cilindro de tecido de diâmetro definido, mantendo o tecido em um ambiente livre de RNase. Por fim, o RNA total é isolado dos núcleos cerebrais removidos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram rendimento e qualidade suficientes de RNA total para a preparação de bibliotecas de cDNA e análise de perfil do transcriptoma por meio de ensaios espectrofotométricos ou fluorométricos.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a excisão de regiões cerebrais assistida por microscopia de captura a laser ou por anatomia macroscópica, é que múltiplas regiões cerebrais discretas de interesse podem ser coletadas a partir de um único cérebro de camundongo de maneira repetível e com custo suficientemente baixo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como se perfis distintos de expressão de transcritos em regiões cerebrais associadas a circuitos neuronais específicos podem estar correlacionados a certos traços comportamentais, respostas ambientais e/ou estados de doença. Para se preparar para a microdissecção, adicione a 100 mililitros de solução salina balanceada de Earle ou EBSS 0,44 gramas de bicarbonato de sódio e 0,884 gramas de glicose.
Trate o EBSS com 0,1 mililitros de DEPC em um frasco ou garrafa autoclavável com tampa de rosca por pelo menos 12 horas. A 37 graus Celsius. Coloque pipetas de vidro de cinco polegadas e três quartos em um béquer de vidro de um litro e posicione pincéis de artista com as cerdas voltadas para cima em um cilindro graduado de vidro de 100 mililitros.
Adicione quantidade suficiente de solução de água tratada com DEPC para cobrir as pipetas e escovas. Cubra o béquer e o cilindro graduado com papel de alumínio e incube por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius. Após a incubação de 12 horas com DEPC, aqueça todos os materiais tratados com DEPC a uma temperatura superior a 100 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Resfrie o EBSS à temperatura ambiente antes do armazenamento a quatro graus Celsius.
Despeje a H2O DD do béquer e do cilindro graduado e continue a incubar ambos a mais de 100 graus Celsius até que os materiais estejam secos. Retire-os da estufa, deixe esfriar à temperatura ambiente e guarde para uso posterior. No dia do experimento, trate todas as superfícies de trabalho para remover contaminação por RNAs e mantenha o EBSS em banho-maria ajustado a 40 graus Celsius para tamponamento e oxigenação.
O EBSS é infiltrado com 5% de CO₂ e 95% de oxigênio colocando uma tubulação de gás em uma pipeta de pasteur livre de RNA. Em seguida, insere-se a pipeta no EBSS, cobrindo a abertura do recipiente do EBSS. Prepare um fatiador de tecidos para o corte em série do tecido cerebral.
Trate as superfícies superior e inferior do cortador de tecidos. Para remover contaminação por RNAs, fixe um pedaço retangular de papel filtro Watman número quatro à superfície de plexiglass do fatiador de tecidos. Fixe uma lâmina de dupla borda ao braço do fatiador.
Acerte o micrômetro em zero e ajuste a altura mínima do braço do cortador para permitir que a lâmina de barbear corte o papel-filtro, mas não a placa de plexiglass. Reúna todos os materiais adicionais necessários para a microdissecação, incluindo placas de cultura celular RNA free de 60 por 15 milímetros, ponteiras de micropipeta RNA free de 200 microlitros, tesoura curva, gelo seco e tubos para coleta de tecido. Coloque os tubos sobre gelo seco após decapitar um camundongo utilizando uma guilhotina para roedores e remover o cérebro inteiro com o cérebro posterior e os nervos ópticos intactos.
Coloque o cérebro na parte superior de uma placa de cultura celular livre de RNAses com dimensões de 60 por 15 milímetros. Em seguida, transfira-o para a superfície de trabalho para amostragem de tecido. Utilize uma pipeta livre de RNAses para umedecer moderadamente o papel filtro acoplado ao cortador de tecidos com EBSS.
Umedeça o tecido cerebral com EBSS. Transfira o cérebro para o cortador de tecidos e posicione-o com a superfície ventral apoiada no papel filtro. A linha média deve ser perpendicular à lâmina do cortador e a borda rostral do cérebro deve encostar na lâmina.
Use uma escova de artista tratada com A-D-E-P-C para manter o cérebro imóvel, aplicando pressão suave sobre a superfície dorsal do cérebro enquanto o mantém fixo. Levante a alavanca do suporte da lâmina cerca de quatro a cinco centímetros acima da superfície do tecido dorsal e mantenha-a nessa posição. Remova a escova da superfície do cérebro e regule 750 micrômetros.
Usando o micrômetro. Deixe a alavanca cair, cortando o tecido e criando uma seção coronal de 750 micrômetros enquanto a lâmina do cortador permanece estacionária. Utilize um movimento de rolagem com o pincel de artista para remover suavemente a seção de tecido da superfície da lâmina.
Coloque imediatamente a seção do tecido no EBSS oxigenado na placa de Petri. Esta fatia está agora pronta para microdissecação. Repita o procedimento de corte até obter seções cerebrais em série ao longo de todo o plano rostrocaudal para realizar a microdissecação.
Primeiro, verifique a iluminação para garantir que a iluminação da amostra não será obstruída. Ajuste a posição e o fluxo da mistura de O2 e CO2 para manter um ambiente oxigenado e tamponado para o tecido. Durante o procedimento, identifique a secção coronal do cérebro que inclui a região de interesse e, utilizando um pincel de artista, posicione-a plana no fundo da placa de Petri.
Selecione o cilindro de tecido com o diâmetro apropriado. Segure o corte coronal do tecido no lugar com o pincel de artista e posicione a ponta cortante do cilindro de tecido sobre a superfície do corte. Aplicando pressão, empurre a ponta do cilindro através do corte de tecido até encostar firmemente no fundo da placa de Petri.
Utilize um movimento circular rotativo para garantir que a região de interesse tenha sido dissociada do tecido circundante. Levante cuidadosamente o fragmento tecidual da seção de tecido e libere o microcorte, permitindo que flutue no EBSS usando um pincel de artista. Deposite imediatamente o microcorte tecidual em um tubo de armazenamento estável a menos 80 graus Celsius mantido sobre gelo seco.
O tecido deve aderir facilmente à parede do tubo. Retorne o tubo contendo a amostra de microdissecação para o gelo seco. Repita essa microdissecção para cada região cerebral de interesse.
Após a conclusão da microdissecção, registre a etiqueta ou os códigos de barras respectivos para cada tubo contendo amostra. Coloque as amostras de tecido em um congelador a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA para extrair RNA das amostras de tecido. Primeiro, prepare um ambiente de trabalho livre de RNA.
Prepare uma quantidade suficiente da mistura de microesferas magnéticas e da solução de lise e ligação conforme descrito no manual do kit de isolamento de RNA total. Retire as amostras de tecido do congelador a menos 80 graus Celsius e coloque os tubos diretamente sobre gelo seco. Adicione 100 microlitros da solução de lise e ligação a um tubo contendo a amostra.
Acople uma haste de 0,5 mililitro de tamanho adequado para tubo livre de nucleases ao misturador de pellets e homogeneíze o tecido utilizando uma ponteira de pipeta livre de nucleases com baixa retenção. Transfira imediatamente a amostra homogeneizada para um poço em uma placa de cultura de tecidos redonda de 96 poços, utilizando o mesmo tipo de ponteira. Adicione 60 microlitros de isopropanol a 100% à amostra.
Adicione 20 microlitros da mistura de esferas à amostra e homogeneíze pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Siga as etapas do protocolo do kit de isolamento de RNA total para concluir a extração de RNA total. Por fim, meça a pureza e a concentração do RNA total resultante. Dados de microdissecções de diversas regiões cerebrais estão apresentados nesta tabela.
Amostras de RNA diluídas com 30 microlitros de Tampão de Eluição forneceram quantidade suficiente de RNA total para uso com produtos comerciais disponíveis para preparação de cDNA destinados a aplicações de sequenciamento de RNA. Além disso, o rendimento de RNA e as razões de 260 a 280 são valores únicos obtidos a partir de amostras respectivas de microdissecção, para demonstrar as leituras obtidas de cada região cerebral, confirmando a alta pureza das amostras. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito a dez minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar o risco de contaminação de RNA em superfícies de trabalho ou amostras de tecido, utilizando apenas materiais livres de RNase ou tratados com DNase.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para o perfilamento da expressão de RNA em regiões cerebrais discretas de camundongos, enfatizando uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecido. O método combina o corte coronal do cérebro com microdissecação assistida por perfurador de tecidos para obter RNA total de alta qualidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Molecular
- Perfilagem de RNA
Antecedentes
- O perfilhamento da expressão de RNA é fundamental para compreender a função cerebral.
- Núcleos cerebrais discretos exigem uma dissecação cuidadosa para uma análise precisa.
- Manter um ambiente livre de RNase é essencial para a integridade do RNA.
- Métodos anteriores apresentavam falta de consistência e reprodutibilidade.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para extração de RNA de regiões cerebrais de camundongos.
- Garantir alto rendimento e qualidade do RNA para aplicações posteriores.
- Facilitar o perfilamento do transcriptoma por meio de métodos aprimorados de coleta de tecido.
Métodos Utilizados
- Preparação de um ambiente de trabalho livre de RNase.
- Decapitação e remoção de todo o cérebro do camundongo.
- Seccionamento uniforme do tecido cerebral usando um cortador de tecidos operado por micrômetro.
- Microdissecação de regiões cerebrais específicas usando um fragmento de tecido em um meio livre de RNA.
Resultados Principais
- Obteve-se alto rendimento de RNA total a partir dos núcleos cerebrais dissecados.
- A qualidade do RNA foi confirmada como adequada para a preparação de biblioteca de cDNA.
- Os resultados apoiam a utilidade do método para o perfilamento de transcriptoma.
- Os ensaios demonstraram qualidade suficiente de RNA para aplicações posteriores.
Conclusões
- O protocolo descrito fornece uma abordagem confiável para a extração de RNA.
- Ele melhora a consistência e a qualidade das amostras de RNA de regiões cerebrais de camundongos.
- Este método é benéfico para pesquisas futuras em neurociência que envolvam análise de RNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa abordagem de microdissecção permite o isolamento reprodutível e com alto rendimento de RNA total de regiões cerebrais murinas discretas, solucionando um gargalo fundamental na validação de alvos em neurociência, onde baixos rendimentos de RNA obtidos por microdissecção com captura a laser dificultam o perfilamento de transcriptoma. Ao fornecer qualidade consistente de RNA adequada para sequenciamento de nova geração, o método auxilia na redução de riscos mecanicistas de alvos do SNC e melhora a confiabilidade preditiva nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta. Posiciona-se como uma alternativa escalável e economicamente eficiente para estudos de expressão gênica específicos de regiões cerebrais na avaliação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante o isolamento de RNA de núcleos cerebrais específicos para correlacionar a expressão de transcritos com a função dos circuitos neuronais e fenótipos comportamentais.
- Valor Operacional: Oferece coleta repetível e economicamente eficiente de amostras de múltiplas regiões discretas por camundongo, reduzindo o uso de animais e aumentando a produtividade para a desvinculação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece RNA total com rendimento e pureza suficientes para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e qRT-PCR, permitindo o desenvolvimento confiável de ensaios para triagem de expressão gênica em modelos de tecido cerebral.
- Valor Operacional: Utiliza isolamento de RNA com esferas magnéticas, compatível com fluxos de trabalho de alto rendimento, apoiando a padronização em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Facilita o perfilamento transcriptômico relevante para doenças em modelos de camundongos, alinhando-se aos esforços de descoberta de biomarcadores translacionais em distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos.
- Valor Operacional: Garante a integridade do RNA por meio de protocolos livres de RNase, melhorando a reprodutibilidade em estudos pré-clínicos longitudinais e a comparabilidade de dados entre laboratórios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese alvo até a identificação de compostos promissores, no qual o perfilagem preciso do RNA em regiões cerebrais específicas orienta a seleção e priorização de alvos antes da validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos ao permitir a comparação transcriptômica entre regiões cerebrais discretas associadas a circuitos neurais específicos.
- Triagem: Produz entradas padronizadas de RNA adequadas para triagem quantitativa de expressão gênica, aumentando a reprodutibilidade em ensaios de engajamento de alvos.
- Análises: Gera RNA de alta qualidade para quantificação espectrofotométrica e fluorométrica, permitindo a normalização precisa da entrada em aplicações baseadas em sequenciamento e PCR.
- Pesquisa Translacional: Conecta o perfilamento de expressão na fase de descoberta à continuidade pré-clínica, fornecendo dados transcriptômicos relevantes para doenças provenientes de regiões cerebrais definidas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável de coleta de tecidos e isolamento de RNA aplicável a múltiplos projetos de neurociência e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de dados precisos de expressão específicos de região cerebral.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de fluxos de trabalho livres de RNase e tempo mínimo de manipulação (8–10 minutos por amostra).
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir múltiplas amostras regionais de um único animal, reduzindo os custos associados a métodos de baixo rendimento que exigem amplificação.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização de alvos ajustada ao risco ao fornecer dados confiáveis de transcriptoma para decisões de avançar/não avançar na descoberta de fármacos para o sistema nervoso central.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento especializado em neuroanatomia e técnica livre de RNase para manter a integridade da amostra durante a dissecção e a extração de RNA.
- Depende do acesso a um cortador de tecidos operado por micrômetro, perfuradores de tecidos com diâmetro fixo e kits de isolamento de RNA baseados em microesferas magnéticas.
- Necessita de protocolos padronizados de ambiente livre de RNase entre equipes para garantir consistência entre estudos na qualidade do RNA.
- A adaptação a outras regiões cerebrais ou espécies pode exigir a otimização do diâmetro do fragmento de tecido e dos parâmetros de corte em seções.
- Limitação prática: a perfuração manual de tecidos pode limitar aplicações de ultra-alto rendimento em comparação com sistemas automatizados de captura a laser, embora ofereça maior rendimento de RNA.
