Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes
15 de fevereiro de 2021
Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.
Estudar regiões cerebrais distintas é um trampolim para compreender a complexidade molecular e estrutural do cérebro. Este protocolo descreve uma dissecção sistemática do cérebro do rato para isolar regiões cerebrais distintas. Na perspectiva da anatomia cerebral, é uma abordagem de cima para baixo que pode ser facilmente reproduzida.
As vantagens deste protocolo são duplas. Em primeiro lugar, essa abordagem oferece uma oportunidade de entender os fundamentos moleculares de pequenas, mas críticas regiões cerebrais. Em segundo lugar, todo este processo de dissecção é suficientemente curto para garantir a preservação da integridade molecular, um pré-requisito crítico de ensaios de volta e molecular.
Este procedimento envolve prática e manuseio delicado. O momento é muito crucial aqui para manter os marcos estruturais, e pode ser alcançado com treinamento e prática adequados. Demonstrando o procedimento de remoção do cérebro do rato estará Seid Muhie, um químico de pesquisa e bioinformático do nosso laboratório.
Demonstrando ainda mais o procedimento de dissecção cerebral do rato estará James Meyerhoff, um neurocientista do nosso laboratório. Para começar, limpe e remova a pele para uma boa aderência. Aperte a maxila da cabeça decapitada com um hemosta e use uma gaze para refletir o couro cabeludo rostrally.
Insira a tesoura curva fina no forame magnum para separar as meninges adesórias. Em seguida, insira a tesoura na abertura da base do crânio onde a medula espinhal passa com a lâmina apontando verticalmente, mas paralelamente e pressionando contra a superfície interna do osso da placa basal, girando a lâmina 45 graus para o lado esquerdo e, em seguida, para o lado direito. Remova o osso occipital no osso intraparietal para expor o cerebelo.
Avance a tesoura rostrally ao longo da sutura sagital média até o bregma, e corte-a levantando para cima para evitar a laceração de cortices cerebrais. À medida que os ossos parietal são levantados, identifique e corte os anexos meningeais restantes. Faça dois cortes paralelos no plano sagital e remova os fragmentos do osso frontal, evitando dilacerar a superfície cerebral.
Ao cortar os acessórios meningeais e os nervos cranianos, inverta o crânio para permitir que a gravidade ajude na remoção do cérebro em um pequeno copo pré-preenchido com solução salina. Mantenha a bulla auditiva intacta para que a anatomia pituitária seja identificável. Faça um corte parasaggital extremamente pequeno em ambos os lados no cume da tenda membrana que está segurando a pituitária em seu lugar, e levante o lóbulo posterior da pituitária com fórceps ultra finos.
Faça um corte sagital entre as margens laterais do lobo anterior da pituitária no nervo trigêmeo mais próximo, em seguida, levante o lobo anterior da pituitária. Direcione a fonte de luz branca sobre o tecido. Coloque o cérebro em um bloco de aço inoxidável pré-resfriado e mantenha o bloco frio ao circundá-lo com gelo em uma solução salina gelada.
Umedeça periodicamente o tecido com solução salina gelada para preservar as estruturas. Posicione o cérebro de tal forma que os cortices cerebrais estão voltados para cima. Usando pequenas fórceps curvas, remova o cerebelo.
Usando a abordagem dorsal, deslize as lâminas fechadas de um pequeno fórceps curvo sob o caloso corpus, e espalhe-o suavemente para retrair o neocórtex bilateralmente para preservar os marcos de linha média criticamente salientes. Eventual lado para cima, estruturas como quiasmo óptico, hipotálamo, lâmpadas olfativas, medulla oblongata, estoque pituitário e ponte pontina seriam visíveis. Tente separar os hemisférios.
Vire o site ventral cerebral para cima e faça um corte sagital médio começando do dorso entre as lâmpadas olfativas nos hemisférios cerebrais. Remova a medula e, em seguida, separe suavemente os dois hemisférios. Em seguida, faça um corte coronal na margem interna das lagoas para obter o cérebro traseiro e separar a medula na margem posterior das lagoas.
Vire o tecido cerebral para uma separação cuidadosa dos dois hemisférios cerebrais. Remova a lâmpada olfativa nesta etapa. Faça um corte coronal um milímetro anterior ao genu do calosum corpus, e remova as lâmpadas olfativas do acessório, seguidas pela separação do córtex pré-frontal medial e lateral.
Corte parcialmente horizontal ou coronally através da porção transversal da comissura anterior da linha média sob o chifre anterior do ventrículo lateral para liberar o núcleo septo dorsalmente e o estriado ventral ventrally. Remova a pequena quantidade do córtex da superfície lateral para remover o núcleo sucumbência e tubérculo olfativo. Separe a porção rostral do estriado corpus do córtex sobrelada através de um bisturi curvo cortado fora da cápsula externa.
Identifique os núcleos septos ou septo e isole-os desta seção. Faça um corte curvo para separar o hipotálamo nesta etapa. Isso será feito usando um corte coronal parcial posterior aos corpos mammillary que se estendem apenas tão lateralmente quanto o sulco hipotalâmico.
Em seguida, liberte a seção transversal de hipotálamo com um corte parasagital ao longo do comprimento do sulco hipotalâmico. Everta o ventrículo lateral para revelar conexões intralíbicas adicionais nos componentes restantes do sistema límbico. Na parte interna do córtex interno, uma estrutura semelhante ao ventilador é observada após a abertura do ventrículo.
Use a estrutura semelhante ao ventilador no córtex entorhinal para definir as margens para fins de dissecção, em seguida, identificar e remover a amígdala, o córtex entorhinal, o córtex cingulado posterior e o hipocampo. Confirme a identificação do tálamo pela visualização da estria medullaris em sua superfície dorsal estendendo-se no plano cortical rostral médio. Separe o tálamo completamente do meio do cérebro por um corte coronal.
Este protocolo pode ser usado para a remoção imediata do cérebro do crânio, seguido de dissecção. Os tecidos dissecados podem ser preservados e processados posteriormente, dependendo das exigências do estudo. RNA extraído de múltiplos tecidos dissecados pode ser testado para expressão genética.
Os resultados representativos foram obtidos utilizando cérebros colhidos que foram armazenados a menos 80 graus Celsius durante vários meses antes da extração do RNA. Regiões cerebrais distintas, juntamente com dados de peso, foram coletadas no estudo o agressor expôs o modelo de estresse social de TEPT. Concentrações de RNA e leituras espectrofotométricas são mostradas aqui.
Ao seguir este protocolo, certifique-se de que os tecidos são resfriados o tempo todo mantendo o cérebro em um bloco de aço gelado, e periodicamente doando o tecido com soro fisiológico. Uma vez que os tecidos são coletados e imediatamente congelados, eles podem ser usados para ensaios como transcriômica, metabolômica e proteômica posteriormente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo prático e passo a passo para a remoção e dissecação do cérebro de camundongo, com o objetivo de isolar regiões cerebrais distintas. O método garante a integridade molecular dos tecidos, facilitando análises transcriptômicas de alta qualidade em regiões cerebrais críticas. O protocolo foi desenvolvido para ser simples e facilmente reprodutível em investigações moleculares na neurociência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Anatomia cerebral
- Análise molecular
Antecedentes
- Compreender a complexidade molecular e estrutural do cérebro é essencial para avanços na neurociência.
- A dissecação de regiões cerebrais distintas permite estudos moleculares direcionados.
- A preservação da integridade do tecido durante a dissecação é crucial para análises subsequentes.
- Treinamento e prática são necessários para realizar corretamente a dissecação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo eficiente para a dissecção de cérebro de camundongo.
- Permitir a análise molecular de regiões cerebrais pequenas, mas críticas.
- Melhorar a qualidade dos dados transcriptômicos obtidos a partir de regiões cerebrais dissecadas.
Métodos Utilizados
- O protocolo envolve a remoção sistemática do cérebro de camundongo do crânio, seguida pelo dissecção de regiões específicas.
- Os passos críticos incluem corte e manipulação cuidadosos para preservar as estruturas e maximizar a integridade molecular.
- Os tecidos dissecados são processados para extração de RNA e podem ser analisados quanto à expressão gênica.
Resultados Principais
- O protocolo garante uma dissecação rápida e precisa de regiões cerebrais de camundongo, mantendo a integridade molecular.
- Permite a extração de RNA para ensaios transcritômicos subsequentes, aprimorando a análise molecular.
- Facilita a identificação e o isolamento de estruturas cerebrais essenciais para investigações futuras.
Conclusões
- Este estudo fornece uma metodologia detalhada para a dissecção do cérebro de camundongo, essencial para pesquisas em neurociência molecular.
- O tecido preservado pode ser utilizado em estudos transcriptômicos para aprofundar a compreensão das funções cerebrais.
- As implicações estendem-se a uma melhor compreensão dos mecanismos neuronais e possíveis aplicações no estudo de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissecação anatômica precisa de regiões do cérebro de camundongo permite a análise molecular direcionada, essencial para a validação de alvos em neurociência. Este protocolo auxilia na triagem fenotípica e na redução de riscos mecanicistas ao isolar estruturas funcionalmente relevantes para ensaios posteriores. A manutenção da integridade do tecido assegura dados transcriptômicos confiáveis para o desenvolvimento de modelos pré-clínicos e a descoberta de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da análise de expressão gênica específica por região.
- Valor Operacional: Fornece amostras anatomicamente definidas para validar o engajamento do alvo em sistemas relevantes para a doença.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao associar alterações moleculares a estruturas cerebrais específicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para o desenvolvimento padronizado de ensaios em neurofarmacologia.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e resultados quantitativos essenciais para a consistência de campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diversas classes de alvos e bibliotecas de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, preservando perfis moleculares específicos de cada região.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de preparação consistente de tecidos em diferentes estudos.
- Alinhamento de Biomarcadores Traducionais: Apoia a identificação de biomarcadores específicos de região que se correlacionam com desfechos fenotípicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto inicial, por meio do perfilhamento molecular com resolução regional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio do isolamento tecidual anatomicamente preciso.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com integridade molecular preservada, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera leituras quantitativas de expressão de RNA que facilitam a comparação entre condições e a priorização de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio do contexto estrutural e molecular preservado.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade padronizada de dissecação aplicável a múltiplos projetos de neurociência e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos específicos de regiões cerebrais.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade para programas de pesquisa em neurociência com múltiplos centros.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos por meio de melhor validação de alvos e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em dados moleculares específicos de regiões obtidos de modelos pré-clínicos validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em neuroanatomia e técnicas microcirúrgicas para identificação precisa de marcos anatômicos.
- Depende de instrumentação, incluindo tesouras curvas finas, pinças e superfícies de dissecação refrigeradas.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de dissecação para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes linhagens de camundongos ou estágios de desenvolvimento.
- É limitado pelos riscos de degradação tecidual se o tempo de dissecação ou o controle de temperatura não forem mantidos conforme o protocolo.
