Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar diversas abordagens virológicas e bioquímicas para analisar o papel de uma via de sinalização do hospedeiro na replicação lítica de um vírus herpes modelo. Aqui, como exemplo, examinamos o papel da proteína de sinalização antiviral mitocondrial Mavs durante a infecção com o vírus herpes gama HV 68. Primeiramente, para examinar o papel do Mavs durante infecção aguda, camundongos selvagens e camundongos knockout para Mavs são infectados com o gama HV 68 após uma infecção viral aguda.

O pulmão do camundongo é coletado e as cargas virais são determinadas por um ensaio de placa no qual as amostras são diluídas em série e plaqueadas. Em monocamadas, o número de placas é então contado. O aumento das cargas virais nos camundongos knockout sugere que o gene de interesse desempenha um papel antiviral.

Por outro lado, cargas virais reduzidas em camundongos knockout indicam que o gene é necessário para a infecção viral. Para validar esses achados, a cinética de crescimento viral multietapa in vitro é analisada em fibroblastos embrionários de camundongo: fibroblastos embrionários de camundongo selvagem e knockout para mavs são infectados com o herpesvírus gama 68 e incubados por diversos períodos. As células são então coletadas e ensaios de placa são realizados para comparar a cinética de crescimento multietapa entre células selvagens e células deficientes em mavs.

Para validar ainda mais esses achados, células de fibroblastos embrionários de camundongos selvagens e com deleção de mavs são infectadas com o herpesvírus gama 68. Em seguida, o DNA e o RNA são extraídos separadamente das células infectadas e os transcritos genômicos virais são analisados por PCR em tempo real. Tivemos pela primeira vez a ideia deste protocolo quando estudávamos o papel de uma via de imunidade do hospedeiro durante uma infecção lítica por vírus.

Este protocolo pode ser potencialmente aplicado para investigar as regras das vias de sinalização do hospedeiro durante a infecção por outros patógenos. Inicie este procedimento permitindo que camundongos jovens de mesma origem genética e sexo, com idade entre seis e oito semanas, se aclimatizem por um período de quatro dias após o transporte. O experimento a seguir será realizado em uma instalação de risco biológico.

Como preparação, coloque os equipamentos de proteção individual, incluindo um jaleco de laboratório, luvas, máscara e sapatos descartáveis, trabalhando em uma cabine de biossegurança nível dois. Prepare a suspensão viral com 40 a 10.000 UFC de gamma HV 68 e 30 microlitros de PBS estéril para cada camundongo que será infectado.

Mantenha a suspensão viral em gelo após uma injeção intraperitoneal de cetamina xilazina. Certifique-se de que os camundongos estejam sedados realizando um aperto no dedo do pé. Em seguida, com uma pipeta, aplique 30 microlitros da suspensão viral gota a gota em uma das narinas, esquerda ou direita.

Coloque o camundongo de lado por cinco a dez minutos para facilitar a entrega do vírus pelas vias aéreas até o pulmão. Em seguida, devolva os camundongos à sua gaiola e monitore-os até que tenham se recuperado completamente da sedação. A seguir, o tecido pulmonar é coletado dos camundongos injetados para preparar um lisado celular destinado à avaliação do título viral em diferentes dias após a infecção.

Coloque os pulmões coletados de camundongos sacrificados em tubos estéreis de 1,5 mililitro com tampa rosqueável contendo 500 microlitros de microesferas de zircônia-sílica de 1,0 milímetro, sobre gelo. Caso não prossiga para o próximo passo no mesmo dia, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.

Caso contrário, adicione um mililitro de DMEM sem soro e frio. Coloque o tubo em um homogeneizador de esferas e pressione iniciar para homogeneizar os pulmões por 30 segundos. Para evitar o superaquecimento da amostra, o que pode inativar o vírus.

Resfrie o tubo em gelo por pelo menos um minuto após 30 segundos de homogeneização. Em seguida, repita este processo. A seguir, centrifugue o tecido homogeneizado a 16.000 RCF a quatro graus Celsius por um minuto.

Após a centrifugação, os detritos celulares estarão no fundo do tubo e os lipídios estarão na superfície. Imediatamente, colete o sobrenadante conforme mostrado aqui para realizar um ensaio de placa utilizando uma monocamada de NIH three T three ou BHK 21. Em seguida, realize um ensaio de placa para determinar o título viral presente na amostra, iniciando o ensaio de placa com a realização de diluições seriadas do sobrenadante viral.

Primeiro, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 270 microlitros de meio a uma placa de 96 poços. Deixe a primeira linha em branco. Em seguida, adicione 200 microlitros de sobrenadante a cada poço da primeira linha da placa de 96 poços, com cada amostra em triplicata.

Em seguida, transfira 30 microlitros da amostra da primeira linha para a próxima linha e homogeneíze. Depois, transfira 30 microlitros da mistura para a próxima linha e homogeneíze. Repita este passo várias vezes para realizar diluições seriadas de dez vezes.

Em seguida, adicione o sobrenadante viral diluído sobre a monocamada de células em uma placa de 24 poços. Coloque a placa em um incubador e agite a placa a cada 30 minutos durante uma incubação de duas horas. Após a incubação, remova os detritos celulares aspirando o sobrenadante da placa.

Em seguida, lave as células uma vez com meio fresco. Após a lavagem, adicione meio contendo metilcelulose às células. Incube as células por quatro a seis dias.

Após quatro a seis dias terem se passado, utilize um microscópio para ler o número de placas para cada amostra. Registre o número de placas para cada diluição.

Em seguida, calcule a média e o desvio padrão. Poços contendo muitas ou poucas placas não podem ser utilizados para calcular com precisão a titulação. Portanto, para cada amostra, utilize uma diluição na qual haja de sete a 70 placas.

Esta amostra diluída 1000 vezes apresenta uma média de 23 placas por poço. Para calcular o título viral na solução não diluída, multiplique o fator de diluição pelo número de placas pelo número de microlitros em um mililitro. Em seguida, divida esse valor pelo volume de sobrenadante diluído adicionado por poço.

Então, neste exemplo, 1000 vezes 23 placas vezes 1000 microlitros por mililitro dividido por 100 microlitros equivale a 2,3 vezes 10 à quinta unidades formadoras de placas por mililitro. Em seguida, uma solução estoque viral com título conhecido é utilizada para determinar a cinética de crescimento do gamma HV 68 em fibroblastos embrionários de camundongo. Comece dividindo mitos selvagens e aqueles deficientes em um gene hospedeiro em uma placa de 24 poços com 10.000 células por poço. No dia seguinte, substitua o meio em cada poço por 0,5 mililitros de uma suspensão de gamma HV 68 com baixa MOI.

Coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius e mantenha a incubação por duas horas. Agite a placa a cada 30 minutos após a incubação. Utilize uma pipeta para remover a suspensão viral e adicione 0,5 mililitros de DMEM completo fresco contendo 8% de soro bovino fetal às células infectadas pelo vírus.

Coloque as células de volta no incubador em diversos dias pós-infecção. Recolha o meio e as células pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira-os imediatamente para tubos estéreis de centrífuga de 1,5 mililitro e congele os tubos a menos 80 graus Celsius para liberar o gamma HV 68 dos Mets.

Realize três ciclos de congelamento e descongelamento. Descongele as células colocando-as a 37 graus Celsius. Em seguida, vortexe e coloque-as novamente no congelador a menos 80 graus Celsius.

Determine o título viral por meio de ensaio de placa utilizando uma monocamada de NIH três T três ou BHK 21, conforme mostrado anteriormente, para verificar se a replicação de DNA ou RNA é afetada pela deficiência em genes virais ou genes do hospedeiro. Inicie com células infectadas em vários dias pós-infecção, descarte o sobrenadante, lave as células com PBS frio e trypsinice as células no gelo. Em seguida, pelletize as células por centrifugação a 1000 RCF à temperatura ambiente por um minuto; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e armazene as células a menos 80 graus Celsius.

Extraia o DNA e o RNA totais, de origem viral e do hospedeiro. Em seguida, centrifugue as colunas de centrifugação. Realize PCR em tempo real utilizando o DNA total e primers específicos para transcritos virais líticos.

Determine a quantidade relativa do genoma intracelular do gamma HV 68 em relação a um gene de manutenção do hospedeiro, como a beta actina. Prepare o cDNA com RNA total e iniciador oligo DT. Realize PCR em tempo real utilizando o cDNA e os iniciadores conforme acima para determinar a quantidade relativa de transcritos virais.

Em referência à do gene de manutenção celular do hospedeiro, Mavs é a abreviação de sinalização antiviral mitocondrial, conforme mostrado aqui. A molécula adaptadora Mavs transmite o sinal proveniente de receptores citosólicos semelhantes ao rig olho para ativar o fator NF kappa B e os fatores reguladores de interferon (IRFs), que por sua vez aumentam a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias e interferons. As cargas virais no pulmão de camundongos selvagens infectados com gamma HV e de camundongos irmãos deficientes em Mavs são mostradas aqui.

A deficiência em Mavs reduziu significativamente as cargas virais no pulmão aos 10 dias pós-infecção, indicando que Mavs é necessário para uma infecção viral eficiente in vivo. Esta figura mostra uma curva de crescimento viral multietapa em fibroblastos embrionários de camundongos do tipo selvagem e naqueles deficientes em Mavs. O crescimento viral foi significativamente retardado em fibroblastos embrionários de camundongos, indicando que Mavs é necessário para a replicação viral eficiente in vitro. Os níveis de mRNA de genes líticos virais em fibroblastos embrionários de camundongos infectados com o herpesvírus gama 68 foram analisados por PCR em tempo real. A deficiência em Mavs reduziu significativamente os níveis de mRNA de três genes líticos essenciais.

Todos esses resultados coletivamente apoiam a conclusão de que Mavs é necessário para a ativação da transcrição do HV-68 gama e para a replicação lítica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar a interação entre hospedeiro e patógeno em múltiplos níveis, tanto em VO quanto em Vevo. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser extremamente cauteloso.

Precauções, como o uso de equipamento de proteção pessoal, devem ser tomadas durante a realização dos procedimentos.