Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3
17 de agosto de 2011
Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a aplicação do Flex Station três para estudar o perfil farmacológico do canal do tipo receptor potencial transitório, ou trip a um. Isso é realizado primeiramente preparando células que expressam canais trip a um em placas de microtitulação de 96 poços.
Após lavar as células em um lavador de microplacas, as células são carregadas com o corante fluorescente sensível ao cálcio. Flu oh 4:00 AM um período de carregamento celular é seguido por várias lavagens adicionais. O próximo passo do procedimento é preparar a placa de compostos, incluindo um agonista trip a um e um antagonista trip a um putativo.
Como etapa final, os parâmetros do software são configurados para leitura da placa no sistema Flex Station três. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram relações de resposta dose-dependente para a ativação do trip A um pelo ácido flu fonêmico e inibição pelo composto antagonista A. Embora este método possa fornecer informações sobre mecanismos de ativação do 21 mediante medição da entrada de cálcio, ele também pode ser aplicado para estudar funções de outros canais iônicos permeáveis ao cálcio e receptores acoplados à proteína G, utilizando corantes congelados sensíveis ao cálcio ou corantes de potencial de membrana.
A principal vantagem desta Tática em relação a métodos existentes, como a imagem de cálcio e o mapeamento manual por patch, é que esta técnica econômica em tempo permite triagem de alto rendimento para a função e modulação de fórmulas de cálcio, canais de ferro e outros receptores mobilizadores de Ca. Antes do início deste protocolo, cultive células HEC 293 estavelmente transfectadas com trip A um até uma densidade de 70 a 90%, conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar o preparo das células para o ensaio de cálcio, revista placas de 96 poços pipetando 50 microlitros de poli-L-ornitina em cada poço e incube as placas a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos.
Após a incubação, lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato de KO. Após a tripsina, transfira a quantidade desejada de células HEC 2 93 para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue a amostra. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular resultante.
No meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, distribua 100 microlitros da suspensão celular em cada poço da placa de 96 poços. Usando um pipetador multicanal, deixe a placa repousar na câmara de fluxo laminar por pelo menos 30 minutos antes de colocá-la no incubador de cultura celular umidificado por 20 a 44 horas. Para o preparo do ensaio de cálcio, prepare primeiro as soluções conforme descrito no protocolo escrito.
Uma vez preparado, misture 10 microlitros de flu oh 4:00 AM a um milimolar com 10 microlitros de ônix. F1 27, transfira todo o conteúdo para cinco mililitros de tampão do ensaio flu. Oh quatro suplementado com 0,1% de albumina sérica bovina.
Em seguida, lave as células cultivadas em placas de 96 poços com HBSS a 80 microlitros por poço duas vezes, utilizando um lavador de microplacas. Após a lavagem, adicione a solução de marcação com fluo-4 AM a 50 microlitros por poço com uma pipeta multicanal e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Durante o período de marcação celular de uma hora, prepare uma série de soluções três vezes concentradas de agonistas, uma série de soluções três vezes concentradas de antagonistas e um grande volume de agonista 300 micromolar no tampão de ensaio com fluo-4.
300 microlitros das soluções diluídas do composto em uma placa de compostos de 96 poços. Organize para que a diluição em série de um composto e os respectivos controles positivo e negativo estejam na mesma coluna da placa de compostos sempre que possível. Como o Flex Station Three lê uma única coluna por vez, pipete 300 microlitros da solução de agonista de 300 micromolar adjacentes a cada poço contendo o antagonista como etapa final de preparação celular.
Lave as células carregadas três vezes com o tampão de ácido fluo-4 usando o lavador de microplacas após a última lavagem. Deixe 80 microlitros do tampão de ácido fluo-4 em cada poço. Para iniciar a leitura da placa, ligue o sistema Flex Station 3 e abra o software SoftMax Pro 5.2.
Salve o experimento com um novo nome de arquivo na configuração. Escolha o modo flex e insira os parâmetros para medir o efeito do agonista e do antagonista conforme listado no procedimento escrito. Em seguida, coloque uma nova caixa de ponteiras, a placa de compostos e a placa de leitura nas bandejas apropriadas da estação flex.Three.
Inicie a leitura da placa clicando no botão de leitura no software Soft Max Pro. O Flex Station três lerá uma coluna por vez e adicionará compostos nos pontos de tempo previamente programados sem interromper a leitura. Após a conclusão do experimento, os dados podem ser processados diretamente usando o software Soft Max PRO ou copiados e colados em qualquer programa de planilha, como o Microsoft Excel.
Para analisar os dados, gere curvas de resposta à concentração para o trip, um agonista ácido flu fonêmico e para o composto putativo antagonista do trip a um utilizando ajuste pelos mínimos quadrados conforme descrito no procedimento escrito trip. O trip a um é um canal catiônico permeável ao cálcio cuja ativação leva à entrada de cálcio, que pode ser detectada pelo corante sensível ao cálcio flu oh 4:00 AM. Traços representativos dos cursos temporais das alterações de fluorescência em resposta a uma série de concentrações de ácido flu fonêmico ou FFA são mostrados em concentrações mais elevadas. A FFA provocou aumento da fluorescência com cinética muito mais rápida do que em concentrações mais baixas, apesar de níveis semelhantes de pico de fluorescência.
Para distinguir essas diferenças, a relação concentração-resposta foi construída mediante a medição das taxas iniciais do aumento da fluorescência. Após a adição de concentrações variadas de FFA, a concentração efetiva máxima metade de FFA foi determinada como sendo 55,4 micromolar. Também é mostrada a relação concentração-resposta de inibição da resposta de cálcio induzida por FFA por um composto antagonista putativo trip a um, composto A.
Uma dose reduziu independentemente a resposta das células triplo A um ao FFA com uma concentração inibitória máxima de 4,3 micromolar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar os perfis farmacológicos do triplo A um e canais relacionados utilizando a estação flag três.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um protocolo para estudar o perfil farmacológico de canais TRPA1 humanos utilizando o FlexStation 3. O procedimento inclui a preparação das células, carregamento com corante e operação do leitor de microplacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Os canais TRPA1 são importantes na transdução sensorial.
- Compreender seu perfil farmacológico pode auxiliar no desenvolvimento de medicamentos.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta versátil para triagem em alto rendimento.
- Corantes sensíveis ao cálcio são utilizados para medir a atividade do canal.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o estudo dos canais TRPA1.
- Demonstrar o uso do FlexStation 3 em estudos farmacológicos.
- Facilitar a compreensão da modulação dos canais TRPA1.
Métodos Utilizados
- Preparação de células expressando canais TRPA1 em placas de microtitulação.
- Lavagem das células utilizando um lavador de microplacas.
- Carregamento das células com corante fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4 AM).
- Preparação de placas de compostos com agonistas e antagonistas de TRPA1.
Resultados Principais
- Carregamento bem-sucedido das células com o corante fluorescente.
- Uso eficaz do FlexStation 3 para medir a atividade de TRPA1.
- Identificação de moduladores de TRPA1 por meio de perfil farmacológico.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo na pesquisa.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar os canais TRPA1.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta eficaz para estudos farmacológicos.
- Compreender a modulação do TRPA1 pode levar a avanços terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o perfilamento farmacológico de canais TRP com produtividade média a alta por meio de medidas de fluxo de cálcio, auxiliando na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Ao quantificar a potência de agonistas e a inibição por antagonistas em um formato automatizado e reprodutível, fornece confiança preditiva para priorizar moduladores de canais iônicos em etapas de descoberta. A abordagem reduz a dependência de eletrofisiologia de baixa produtividade, acelerando a evolução de compostos ativos para candidatos pré-clínicos em alvos sensoriais e fisiopatológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa a função do canal TRPA1 por meio da entrada de cálcio dependente da dose, permitindo a confirmação mecanicista do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Utiliza células HEK293 que expressam o TRPA1 humano para estabelecer um modelo de superexpressão transponível para investigação farmacológica.
- Valor Preditivo: Gera valores de CE50 e CI50 (55,4 µM e 4,3 µM, respectivamente) para apoiar a relação estrutura-atividade no início da identificação de compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece leituras quantitativas e em tempo real de fluorescência por meio do Fluo-4 AM, permitindo a avaliação do fator Z' e a análise da robustez do ensaio.
- Compatibilidade com Alto Rendimento: Aproveita a leitura coluna por coluna do FlexStation 3 com transferência automatizada de fluidos para triagem no formato de 96 poços.
- Compatibilidade de Reagentes: Demonstra o uso de corantes sensíveis ao cálcio e de pipetagem multicanal para carregamento consistente do corante e entrega de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para doenças: O papel do TRPA1 na nocicepção sustenta seu uso como um indicador mecanicista para a modulação de vias da dor em triagens pré-clínicas de segurança e eficácia.
- Continuidade translacional: Permite consistência entre diferentes formatos, desde modelos de superexpressão até a validação em tecidos nativos, utilizando o mesmo princípio de leitura de fluxo.
- Utilidade na redução de riscos: Reduz resultados falso-positivos ao confirmar o fluxo de cálcio como leitura funcional antes de investir em modelos de patch-clamp ou in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no fluxo de trabalho de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, fornecendo uma etapa intermediária escalonável entre a confirmação de superexpressão e a validação eletrofisiológica secundária.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a modulação de canais TRP ao isolar o fluxo de cálcio como uma saída funcional direta da ativação do canal.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da adição automatizada de reagentes e leitura cinética no modo Flex.
- Análises: Gera curvas concentração-resposta baseadas na taxa inicial, permitindo a discriminação cinética da eficácia do agonista além da amplitude máxima.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao estabelecer uma leitura conservada (fluxo de cálcio) aplicável em diversos sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de outros canais permeáveis a Ca2+ (por exemplo, TRPV1, TRPM8) e receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando a mesma configuração de corante e leitor.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece desvio de risco mecanicista ao confirmar a modulação do alvo por meio de um segundo mensageiro direto e quantificável (Ca2+).
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de leitura automatizada de placas e análise cinética.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos ao gerar perfis farmacológicos precoces com limiares de potência definidos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de moduladores de canais iônicos com base na potência funcional e seletividade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, transfeção transitória/estável e manipulação de corantes fluorescentes.
- Depende do FlexStation 3 com modo FLEX, SoftMax Pro e um lavador de microplacas para manipulação automatizada de fluidos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de carregamento de corantes e do formato das placas de compostos para resultados consistentes.
- A adaptação a células nativas ou primárias pode exigir otimização dos níveis de expressão e da fluorescência de fundo.
- Limitado a leituras fluorescentes; incompatível com corantes suscetíveis à quenchagem ou compostos que interferem na excitação/emissão do Fluo-4 AM.
