Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica
23 de agosto de 2012
Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.
O objetivo geral deste procedimento é criar um arranjo proteico modular que não exija uma etapa de purificação, tornando-o compatível com qualquer biblioteca de proteínas. Isso é realizado primeiramente gerando genes sintéticos por meio de PCR de montagem. Em seguida, os genes sintéticos são dispostos em lâminas epóxi.
Para fabricar o dispositivo microfluídico, utilize PDMS com moldes de controle e fluxo de silicone. Em seguida, o dispositivo microfluídico é alinhado ao arranjo de DNA impresso. Por fim, o lisado de reticulócito de coelho é introduzido no dispositivo microfluídico e as proteínas são expressas.
No fim, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão de milhares de proteínas por meio de marcação com anticorpos fluorescentes. Existem várias vantagens no uso da técnica baseada em microfluídica em comparação com métodos existentes, como microarranjos de proteínas. Fazemos microarranjo de DNA e depois utilizamos células para produzir proteínas no dispositivo.
Assim, não exigimos purificação de proteínas e as proteínas nunca secam. Elas permanecem frescas durante todo o experimento. A técnica microfluídica também oferece maior sensibilidade. Para fabricar o dispositivo microfluídico, exponha os moldes de controle e fluxo de silicone ao vapor de cloro trimetil silano por 10 minutos para promover a liberação do elastômero.
Após as etapas de aquecimento, prepare uma mistura de elastômero à base de silicone e agente de cura em duas proporções diferentes: cinco para um e 20 para um, respectivamente, para as moldes de controle e de fluxo. Despeje o PDMS na proporção de cinco para um sobre a camada de controle. Desgaseifique a camada de controle e aqueça-a por 30 minutos a 80 graus Celsius.
Em seguida, aplique por centrifugação a mistura de PDMS na proporção de 20 para 1 na camada de fluxo a 2.600 RPM durante 60 segundos e, depois, aqueça-a a 80 graus Celsius por 30 minutos. Separe lentamente a camada de controle do molde, tomando cuidado para não destacar o padrão de SU-8. Em seguida, utilizando um bisturi, corte o dispositivo ao longo do seu perímetro e use uma agulha romba para perfurar orifícios que permitam o acesso aos canais de controle sob microscópio.
Alinhe manualmente as camadas de fluxo e de controle começando pelo canto superior esquerdo e posicionando a válvula de botão na camada de controle no centro da câmara de reação. Em seguida, alinhe a primeira linha e solte suavemente a camada de controle linha por linha. Certifique-se de que todas as válvulas de botão estejam no centro das câmaras de reação e de que as válvulas de endereço e de entrada cruzem os canais de fluxo na posição correta.
Repita o processo localmente até que todas as linhas estejam alinhadas. Quando totalmente alinhadas, libere qualquer tensão no PDMS levantando-o cuidadosamente pelas laterais e cantos. Em seguida, aqueça o dispositivo por duas horas a 80 graus Celsius após a calcinação.
Recorte ao redor do perímetro e retire o dispositivo de duas camadas dos orifícios do molde de fluxo para acessar os canais de fluxo e gerar construtos de DNA para o dispositivo. Realize PCR para produzir genes sintéticos compostos por um promotor T sete, um sítio de ligação ao ribossomo, um quadro de leitura aberto com diferentes marcadores de epítopo em ambas as extremidades e um terminador T sete. Para preparar os genes sintéticos para a montagem em matriz, prepare uma mistura de polietilenoglicol e di-hidrato de D-triose. Distribua dois microlitros por reação nos poços de uma placa de 384.
Placa de poços. Adicione os genes sintéticos em uma placa de 384 poços. Em seguida, adicione água destilada até um volume final de 20 microlitros.
Em seguida, utilizando um ponto de microarranjo, depositar uma série de genes sintéticos em lâminas de vidro revestidas com epóxi. Sob um estereoscópio, alinhar manualmente o dispositivo microfluídico ao arranjo gênico, posicionando o ponto de DNA no centro das câmaras de DNA. Depois, alinhar sequencialmente as demais fileiras.
Finalize com o ajuste fino de todo o dispositivo para aliviar qualquer tensão no PDMS e garantir que ele adere bem ao microarranjo. Levante-o localmente. Por fim, una o dispositivo à lâmina de vidro incubando-o durante a noite em uma placa aquecedora a 80 graus Celsius.
Cores alimentares são utilizados nesta seção para fins de visualização. As válvulas na camada de controle são acionadas a partir do computador usando o LabVIEW. O script do LabVIEW controla uma série de válvulas microsolenoides por meio de uma caixa de controle eletrônico.
O conjunto de válvulas solenoides é conectado ao ar comprimido, o qual controla o fluxo de ar e a pressão nas válvulas de controle do dispositivo. Utilizando uma tubulação plástica flexível com diâmetro interno de 0,02 polegadas e um pino de aço inoxidável, conecte o dispositivo ao conjunto de válvulas solenoides. Encha os tubos com água bidestilada e insira o pino nos orifícios de acesso da camada de controle.
Certifique-se de que cada tubo esteja conectado ao seu canal de controle correspondente. Para ativar os canais de controle, execute o aplicativo LabVIEW, ajuste a pressão do ar para cinco PSI e, em seguida, aplique pressão de ar ativando a válvula por meio do script do LabVIEW. Isso empurrará água para dentro dos canais de controle de PDMS para identificar possíveis interferências entre os canais de controle de dispositivos defeituosos.
Preencha primeiro as válvulas do sanduíche e de endereço. Afinal, os canais de controle e as válvulas estão cheios de água; prepare as válvulas para bloquear os canais de fluxo sob eles. Primeiro, aumente a pressão de ar para 15 PSI e, em seguida, no programa de visualização do laboratório, use um conjunto de interruptores liga-desliga conectados a válvulas solenoides individuais.
Ative todas as válvulas ligando todos os botões interruptores para garantir que todas as válvulas estejam abertas. Conecte um tubo a uma das entradas de fluxo e, com uma pressão de quatro a cinco PSI, insufla ar no dispositivo. Isso liberará quaisquer válvulas aderidas à lâmina de vidro.
O dispositivo agora está condicionado e pronto para fins de visualização. Corante alimentar amarelo é utilizado para visualizar os reagentes nesta seção, e a solução incolor representa os hippies para facilitar a automontagem de uma matriz proteica na superfície e prevenir absorção não específica dentro do dispositivo microfluídico; modifique quimicamente a superfície conectando primeiro um novo tubo com a solução necessária a um dos canais de fluxo do dispositivo. Em seguida, conecte o lado livre do tubo ao manifold manual e abra o fluxo de pressão de ar.
Carregue 40 microlitros de BSA biotinilada em um novo tubo e faça passar aproximadamente metade pelo dispositivo durante 20 minutos. Utilize hipotônico 50 milimolar para lavar qualquer substrato não reativo entre cada um dos passos. Em seguida, faça passar 25 microlitros de estreptavidina durante 20 minutos.
Na parte superior do botão, lave a BSA biotinilada com HES por cinco minutos para remover o material da superfície ao redor do botão, feche a válvula do botão e faça passar o restante da BSA biotinilada; em seguida, lave novamente com HEPES por cinco minutos. Por fim, para criar uma matriz de anticorpos contra a marcação His sob o botão, abra a válvula do botão e faça fluir 30 microlitros de Penta-His biotinilado por 20 minutos, formando assim uma matriz de proteínas no dispositivo. Abra as válvulas do pescoço e faça passar reticulócito de coelho.
Solução rápida de reação acoplada de transcrição e tradução através do dispositivo na câmara de DNA. Em seguida, feche as válvulas tipo sanduíche para separar cada gene do seu ambiente e incube o dispositivo em uma placa aquecida por 2,5 horas a 30 graus Celsius. Então, marque a extremidade final das proteínas com o anticorpo C mix SI três.
Por fim, utilizando um scanner de microarranjos com laser de 532 nanômetros e filtro de emissão de 575 nanômetros, determine os níveis de proteína. Esta figura mostra os diferentes níveis de expressão proteica em um arranjo de proteínas.
Normalmente, 20% de uma biblioteca gênica não é expresso em níveis detectáveis. Os níveis de fundo foram determinados utilizando câmaras que não foram revestidas com DNA. Assim, os sinais provenientes das câmaras proteicas correspondentes devem-se a ruído ou à absorção não específica dos anticorpos marcadores.
Se for realizada corretamente, a verificação do dispositivo leva quatro horas e o experimento com o chip leva cinco horas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem microfluídica para a expressão de matrizes de proteínas, utilizando um dispositivo com milhares de câmaras de reação controladas por válvulas micro-mecânicas. A integração de uma biblioteca gênica impressa em microarranjo permite a transcrição e tradução no chip, resultando em uma matriz de proteínas pronta para uso.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Expressão Proteica
- Bibliotecas Genéticas
Antecedentes
- As matrizes de proteínas são essenciais para diversos ensaios biológicos.
- Os métodos tradicionais frequentemente exigem etapas de purificação, limitando a compatibilidade.
- Dispositivos microfluídicos podem agilizar o processo de expressão proteica.
- A PCR de montagem é utilizada para gerar genes sintéticos destinados à montagem em matriz.
Objetivo do Estudo
- Criar um arranjo proteico modular sem etapas de purificação.
- Aumentar a compatibilidade com qualquer biblioteca de proteínas.
- Melhorar a eficiência da expressão proteica utilizando microfluídica.
Métodos Utilizados
- Geração de genes sintéticos por meio de PCR de montagem.
- Organização de genes sintéticos em lâminas epóxi.
- Fabricação de um dispositivo microfluídico utilizando PDMS.
- Fluxo de lisado de reticulócitos de coelho no dispositivo para expressão proteica.
Resultados Principais
- Um dispositivo microfluídico funcional foi criado com sucesso.
- As proteínas foram expressas em chip sem purificação.
- O método demonstrou compatibilidade com diversas bibliotecas de proteínas.
- A transcrição e tradução em chip foram efetivamente realizadas.
Conclusões
- Essa abordagem microfluídica simplifica a criação de matrizes de proteínas.
- Elimina a necessidade de purificação, aumentando a facilidade de uso.
- A técnica pode ser aplicada a diversas bibliotecas de proteínas para pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma de expressão proteica microfluídica permite a geração em alto rendimento de arranjos funcionais de proteínas sem purificação, abordando um gargalo fundamental na validação de alvos e na triagem de interações. Ao manter as proteínas em um estado nativo, não desnaturado, no chip, o método possibilita a detecção confiável de interações proteína-proteína, proteína-DNA e proteína-RNA. Essa capacidade aumenta a confiabilidade preditiva no estágio inicial de descoberta, reduzindo falsos negativos decorrentes da perda ou mau dobramento proteico durante a purificação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a validação funcional de alvos mediante a expressão de proteínas de comprimento completo com dobramento correto e modificações pós-traducionais.
- Valor Operacional: Elimina etapas de purificação, reduzindo perda de amostra e aumentando a produtividade para triagem em larga escala de bibliotecas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados quantitativos de expressão para milhares de variantes em paralelo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera matrizes padronizadas de proteínas diretamente a partir de modelos de DNA, garantindo consistência entre lotes para ensaios de interação reproduzíveis.
- Valor Operacional: Integra a montagem de matrizes gênicas e a expressão proteica em um único dispositivo microfluídico, minimizando o tempo de manipulação manual e o risco de contaminação cruzada.
- Prontidão para Ensaios: Produz sinais fluorescentes quantificáveis compatíveis com leitores de microarranjos para mapeamento de interações em alta densidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite o perfilamento rápido de interações proteicas em alvos relevantes para doenças identificados em estudos omicos anteriores.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a triagem de autoanticorpos ou eventos de ligação terapêutica utilizando amostras de pacientes em arranjos de antígenos expressos.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: Permite a avaliação precoce de ligações fora do alvo ou perfis de cruzamento antes de avançar com candidatos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da preparação de bibliotecas genéticas sintéticas à triagem de interações, permitindo uma transição contínua da identificação de alvos à validação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a expressão de genes em matriz para avaliar a atividade funcional de proteínas sem viés de purificação.
- Triagem: Fornece matrizes padronizadas de proteínas frescas, prontas para uso imediato em ensaios bioquímicos ou de interação biofísica.
- Análises: Oferece leituras quantitativas baseadas em fluorescência que permitem comparar níveis de expressão e afinidades de ligação em milhares de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta variantes genéticas a resultados funcionais de proteínas, permitindo a correlação com dados fenotípicos ou clínicos.
- Reutilização Empresarial: A plataforma microfluídica pode ser reprogramada com novas matrizes de DNA, apoiando campanhas iterativas de triagem em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao expressar proteínas em seu estado nativo, reduzindo artefatos decorrentes da purificação ou desnaturação.
- Valor Operacional: Permite o processamento paralelo de milhares de reações em um espaço compacto, melhorando a eficiência de reagentes e a produtividade.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção ao gerar rapidamente dados de interação para grandes bibliotecas de variantes.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis abrangentes de interação e fidelidade de expressão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na fabricação de dispositivos microfluídicos, incluindo moldagem de PDMS e alinhamento de camadas.
- Depende do acesso a equipamentos de microarranjo para geração de matrizes de DNA e sistemas de controle microfluídico (por exemplo, LabVIEW com válvulas solenoides).
- Necessita de protocolos padronizados para preparação de bibliotecas gênicas, incluindo PCR de montagem e marcação com epítopos para detecção.
- Envolve a otimização dos tempos de incubação e das concentrações de reagentes (por exemplo, lisado de reticulócito de coelho, reagentes biotinilados) para objetivos específicos de expressão proteica.
- É limitado pela disponibilidade de instalações para fabricação microfluídica e pela habilidade técnica necessária para alinhamento e ligação precisos das camadas.
