CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Olá, meu nome é Richard Lin e sou pesquisador no grupo da Professora TI Mercy, na Divisão de Ciências da Saúde e Tecnologia de Harvard MIT. O projeto em que estou trabalhando tem como objetivo quantificar e capturar linfócitos T CD4 positivos e C3 positivos. O sangue do paciente será utilizado em contextos com recursos limitados.

Aqui bem à minha frente temos um dispositivo microfill composto por PDMS, que é o polimetilsiloxano. O dispositivo, o canal propriamente dito, tem altura de 50 micrômetros e o volume total no dispositivo é de 10 microlitros. Este é, portanto, um dispositivo extremamente preciso que será usado para capturar linfócitos T auxiliares.

Basicamente, o padrão diagnóstico para pacientes com HIV. Assim, a superfície do dispositivo microfluídico já foi preparada com proteína e anticorpos positivos para CD4 na seringa. Neste momento, temos apenas tampão biológico PBS com pH de 7,4, e agora iremos fluir isso pelo canal para remover o anticorpo positivo para CD4 em excesso.

Nesta etapa, a taxa não precisa ser controlada, pois estamos apenas tentando remover o excesso de material, e na verdade não importa qual seja nossa taxa. Aqui é onde estarão as entradas do dispositivo, e aqui estarão as saídas, à minha esquerda e à sua direita. Agora vou remover a solução excedente de anticorpo e, se você observar a saída, verá o fluido saindo; é uma quantidade muito pequena, mas, se observar atentamente, poderá ver o fluido sendo expulso pelo canal através da tubulação.

Agora que removemos a solução de anticorpo em excesso, podemos nos preparar para injetar o sangue. Então, agora vou desconectar a tubulação da entrada. Agora abriremos uma nova seringa para o sangue, sangue humano, sangue integral.

Então, não se trata de uma amostra de paciente, mas sim de uma amostra de um indivíduo saudável, enquanto nos preparamos para injetar o sangue no dispositivo microfluídico. Vamos acoplar a seringa à bomba de seringa. Agora vamos ligá-la e você pode observar as taxas de fluxo da seringa; configuramos para cinco microlitros por minuto.

E agora basicamente nos prepararemos para injetar no sangue. Colocaremos o bomba de seringa verticalmente porque, como sabemos, as células sanguíneas sedimentam e queremos que as células fluam para o canal. Assim, é preferível que o sedimento celular se deposite na parte inferior, que está bem próxima à nossa tubulação.

Agora, tudo está configurado e pronto para começar. O volume do meu dispositivo é de 10 microlitros por 10 microlitros. E o volume que queremos fluir para a parede do canal também é de 10 microlitros.

Então, posso verificar se introduzi sangue suficiente apenas observando a cor do canal; se estiver totalmente vermelho e completamente preenchido, sei que introduzi 10 microlitros e devo parar o êmbolo da seringa. Agora vou pressionar o botão de início e ele começará, às vezes demora um pouco até o sangue realmente entrar no canal. Isso ocorre principalmente devido à pressão.

Por exemplo, quando colocamos a seringa, às vezes, sabe, recuamos ou injetamos o fluido conforme necessário para ajustar o sangue no tubo. Então, pode demorar um pouco, mas uma vez que começa a bombear para um canal, a taxa de fluxo é definida em ly por minuto, que é o que queremos. Portanto, talvez precisemos ser um pouco pacientes aqui e esperar; às vezes, é necessário esperar cerca de dois ou três minutos antes que o sangue comece a fluir para o canal.

Na verdade, você pode ver agora que o sangue está começando a entrar no canal. Então, dá para perceber que o dispositivo já está quase completamente cheio. Ok, agora vamos trocar o tubo de volta para PBS para lavar o sangue que está no canal.

E para fazer isso, repetiremos o que já fizemos para remover o tubo. Como ainda precisamos controlar a taxa de fluxo do PBS, continuamos precisando da bomba de seringa. No entanto, como não estamos mais fazendo passar sangue, não precisamos manter a bomba de seringa na posição vertical, pois não há células no PBS.

Agora estamos prontos e vamos agora remover o sangue do dispositivo; pressionarei novamente o botão afiado bem aqui. Como podem ver, o dispositivo está começando a se limpar. Ainda há um pouco de sangue nas bordas, mas está desaparecendo lentamente.

Assim, quando todo o sangue tiver sido removido, aumentaremos a taxa de cinco microlitros por minuto para 20 microlitros por minuto. E o motivo dessa alteração é que no sangue existem na verdade dois tipos celulares que possuem antígenos C quatro positivos. Um deles é o que estávamos procurando, os linfócitos T auxiliares.

O outro é o que chamamos de monócitos. Queremos garantir que nosso dispositivo capture especificamente apenas os linfócitos T auxiliares, e não ambos, os linfócitos T auxiliares e os monócitos. E o método que utilizamos para isso é aumentar a taxa de fluxo, porque sabemos que os monócitos são maiores em tamanho do que as células T auxiliares.

Assim, ao aumentar as taxas de fluxo, os monócitos maiores sofrerão maior pressão para deixar a superfície do que as células T auxiliares CD4 positivas. Agora está em torno de 20 minutos. Na minha mão neste momento está uma solução.

É chamado solução de licenciamento fax. O objetivo dela neste caso é lisar glóbulos vermelhos. Assim, em qualquer local onde glóbulos vermelhos permaneçam no canal, esta solução os lisará.

Isso é diluído 10, 10 vezes a partir da solução estoque. Agora o que vamos fazer é parar a bomba de seringa, remover o tubo e, basicamente, substituir a solução pela da seringa. Então, agora estou parando a máquina, removendo o tubo, tirando isso, pegando com esta seringa e substituindo por uma nova.

Ok, agora que tenho tudo configurado, vamos reduzir a taxa novamente para cinco microlitros por minuto. Então, clicaremos na taxa de 20 e a reduziremos para cinco, e agora vamos fluir a solução de fax license por 20 minutos. E agora vamos pressionar iniciar.

Então, diante de nós agora está uma imagem óptica do dispositivo obtida com ampliação de 10 x. Assim, é possível identificar todos esses pontos brancos aqui. Como podemos garantir que essas células são aquelas que estamos procurando?

Então, usamos algumas colorações diferentes para garantir. A primeira coloração que usamos é o que chamamos de DAPI, que cora o núcleo. Basicamente, todas as células com núcleo, como os glóbulos brancos, serão coradas, enquanto as células vermelhas, que não possuem núcleo, não serão coradas. É possível observar que está distribuído por toda a imagem, com todos esses pontos azuis, e cada um desses pontos azuis representa uma célula.

é uma célula. Agora, o próximo passo é verificar se as células possuem o antígeno C four positivo, como o chamamos. Isso é extremamente importante porque toda a finalidade do nosso dispositivo é capturar células C four positivas.

Então, o próximo, o anticorpo fluorescente que usamos é claro específico para C4. E avance para o próximo slide. Nesta imagem, as células aparecem muito mais fracas porque o anticorpo fluorescente que usamos é normalmente para FACS.

Assim, a diluição é muito maior. Mas, se observar com bastante atenção, ainda é possível perceber que existem pontos espalhados por todo este campo de visão. Eles são bastante fracos.

Mas ao examinar mais atentamente, podemos constatar que essas células são positivas para DC, o que é bom, pois é exatamente isso que queremos. E o próximo teste é, como mencionei anteriormente, existem dois tipos diferentes de células positivas para C quatro. Um tipo são as células T auxiliares, que são as que queremos, e o outro são as chamadas monócitos.

Portanto, novamente precisamos de outro anticorpo fluorescente para diferenciar entre as duas células. Sabemos que nos linfócitos T auxiliares existem os antígenos que chamamos de CD3 positivos. Já nos monócitos, isso não ocorre.

Então, o próximo anticorpo que usamos é específico para CD3, que veremos nesta imagem. Mais uma vez, é possível perceber que os pontos estão espalhados pelo dispositivo; os pontos parecem maiores porque, às vezes, algumas células brilham mais intensamente, enquanto outras não brilham tanto. Quero dizer, muitas coisas dependem do acaso neste caso, mas na maioria das vezes, esses pontos, em vermelho brilhante, são todas células.

Então, novamente, o que queremos é garantir que nossas células sejam positivas para CD4 e positivas para CD3. Neste caso, pode-se observar que muitas de nossas células são positivas para CD3, o que é bom, pois nos confere especificidade na nossa captura.

Os grandes positivos, podem ser lixo, mas muitas vezes o que acontece é que, às vezes, uma célula simplesmente acaba acumulando mais CD3 em sua superfície, ligando CD3 a si mesma. Então, nesta imagem, este é um dos conjuntos de dados que coletamos para este dispositivo microfluídico e é basicamente um perfil de captura celular. Então, no caso anterior, você sabe, lâminas, entre outros, é possível perceber que havia muitas, você sabe, imagens com células sobre elas.

Mas a que se acumulam exatamente? Bem, acumulam-se a um perfil de captura celular, no qual podemos representar no eixo X a distância da entrada e no eixo Y o disco de captura celular. E pode-se observar que ao longo do dispositivo, a densidade inicialmente é extremamente alta e depois diminui lentamente, o que é exatamente o que esperaríamos, pois estamos capturando células C4 positivas e C3 positivas da corrente sanguínea, e haverá uma diminuição na concentração dessas células na amostra de sangue.

E é basicamente assim que nossos dados são geralmente apresentados.