Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based
18 de novembro de 2011
Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.
O objetivo geral deste procedimento é criopreservar embriões de camundongo em nitrogênio líquido e descongela-los para recuperação de camundongos vivos. Isso é realizado primeiramente imergindo embriões de camundongo em meio de equilíbrio, transferindo-os para meio de vitrificação em um tubo criogênico e, em seguida, colocando-os em um tanque de nitrogênio líquido. Posteriormente, os embriões podem ser descongelados em um meio de alta osmolaridade e incubados em meio de cultura até serem transferidos para fêmeas receptoras.
No final, os resultados mostram uma sobrevivência de mais de 90% dos embriões após o descongelamento por vitrificação e taxas de natalidade entre 30 e 70% após a transferência embrionária. A principal vantagem dessa técnica é que o crioprotetor permeável glicol é menos tóxico para os embriões do que o crioprotetor convencional. A demonstração do procedimento será feita por um técnico do meu laboratório antes do início deste protocolo.
Prepare dois embriões de camundongo em cultura obtidos por acasalamento natural ou por técnicas convencionais de fertilização in vitro para um tubo de criopreservação para armazenamento futuro; adicione 50 microlitros de solução de congelamento de embriões EF S 40. Em seguida, prepare uma placa de Petri plástica de 35 milímetros ou 60 milímetros com 50 microlitros de EFS 20 à temperatura ambiente.
Use um capilar de vidro para transferir até 30 embriões para a placa. Tenha cuidado para evitar a transferência do meio de cultura. Além disso, para garantir a desidratação dos embriões, coloque-os na parte inferior da gota.
Após cerca de 60 a 90 segundos, utilize um tubo capilar para aspirar embriões desidratados. Com morfologia encolhida. Transfira esses embriões para a solução EFS no tubo criogênico, transferindo o mínimo possível de EFS 20.
Após a transferência dos embriões, deixe-os assentar no EFS 40 por um minuto antes de congelá-los em nitrogênio líquido. Antes do descongelamento dos embriões, coloque em uma placa de cultura pelo menos duas gotas de 10 microlitros de meio de cultura de embriões com alta osmolaridade, como o meio M 16. Em seguida, cubra completamente as gotas com óleo de silicone ou mineral e coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono até o uso.
Em seguida, aqueça a solução TS um a 37 graus Celsius usando máscara facial e luvas criogênicas. Retire os embriões do tanque de nitrogênio líquido. Abra rapidamente o tubo criogênico e descarte qualquer nitrogênio líquido no tanque ou em um recipiente apropriado.
Em seguida, espere 30 segundos. Agora, adicione 850 microlitros da solução morna de TS um ao tubo de criovial. Aspire e expulse suavemente a solução cerca de 10 vezes para que se dissolva uniformemente.
Em seguida, transfira todo o volume para uma placa de Petri plástica de 60 milímetros. Ou espere três minutos em uma lâmina de relógio para que os embriões se equilibrem à temperatura ambiente, onde devem permanecer pelo restante do procedimento. Não utilize um dispositivo de aquecimento.
Examine rapidamente os embriões na placa sob um microscópio estereoscópico para verificar como eles se apresentam no início desta incubação. Após cerca de dois minutos de incubação, acomode os embriões agitando suavemente a placa até que o meio se espalhe pela superfície da placa. No último minuto da incubação, ejetar três gotas separadas de 50 microlitros da solução TS dois em uma placa.
Quando os três minutos terminarem, use um microscópio estereoscópico para confirmar que os embriões encolheram ligeiramente. Se os embriões ainda estiverem inchados, continue a incubação por mais um a três minutos. Agora, pegue os embriões com uma capilar de vidro e transfira-os para a primeira gota de TS dois.
Aguarde três minutos e transfira os embriões para a segunda gota. Em seguida, para a terceira gota. Por fim, retire o prato com meio para embriões preparado armazenado no incubador e utilize uma capilar de vidro para transferir os embriões para a primeira gota do meio.
Se examinados sob um estereoscópio, os embriões devem recuperar lentamente sua morfologia normal. Agora, retorne a placa ao incubador por cerca de 10 minutos. Em seguida, lave o sacarose que foi carreado do TS dois.
Transfira os embriões para a próxima gota de meio de cultura. Continue a cultura dos embriões na incubadora de CO2 até que sejam transferidos para o útero de fêmeas receptoras. Após a vitrificação e recuperação de entre 300 e 480 embriões de três linhagens diferentes de camundongos, a viabilidade foi muito alta.
Após o descongelamento, a fração de embriões que apresentavam morfologia normal estava entre 93 e 99%, e pelo menos 84% desses embriões se desenvolveram em blastocistos. Não se esqueça de que trabalhar com vazamento de nitrogênio pode ser extremamente perigoso, e são necessárias precauções para evitar contato direto e minimizar a exposição em curtas distâncias ao vazamento. O nitrogênio deve sempre ser manipulado realizando este procedimento.
Visão Geral
Este artigo descreve um método de vitrificação baseado em etileno glicol para criopreservação de embriões de camundongo. Esta técnica é vantajosa devido à sua simplicidade e baixa toxicidade embrionária, tornando-a adequada para diversas linhagens de camundongo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Reprodutiva
- Embriologia
Antecedentes
- A vitrificação é um método utilizado para preservar amostras biológicas em baixas temperaturas.
- Os crioprotetores convencionais podem ser tóxicos para embriões.
- O etileno glicol é uma alternativa menos tóxica para a preservação de embriões.
- Este método pode ser aplicado a camundongos endogâmicos e modificados geneticamente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples e eficaz para criopreservar embriões de camundongo.
- Avaliar as taxas de sobrevivência e nascimento de embriões após vitrificação e descongelamento.
- Fornecer um protocolo que possa ser amplamente adotado em laboratórios.
Métodos Utilizados
- Os embriões são imersos em meios de equilíbrio e vitrificação.
- Os embriões são armazenados em nitrogênio líquido para criopreservação.
- O descongelamento envolve a transferência dos embriões para um meio de alta osmolaridade.
- Os embriões são cultivados até estarem prontos para transferência para fêmeas receptoras.
Resultados Principais
- Foram observadas taxas de sobrevivência superiores a 90% após o descongelamento.
- As taxas de natalidade variaram de 30% a 70% após a transferência de embriões.
- Os embriões apresentaram recuperação normal da morfologia após o descongelamento.
- Foram registradas altas taxas de desenvolvimento em blastocistos.
Conclusões
- O método baseado em etilenoglicol é eficaz para a criopreservação de embriões de camundongo.
- Essa técnica minimiza a toxicidade embrionária em comparação com os métodos tradicionais.
- É uma opção viável para diversas linhagens de camundongos na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação robusta de embriões de camundongos geneticamente diversos sustenta a continuidade da pesquisa translacional e a flexibilidade dos processos na biofármaca. A vitrificação baseada em etileno glicol permite alta sobrevivência embrionária e ampla aplicabilidade entre linhagens, apoiando o gerenciamento escalável de colônias e a preservação de recursos genéticos. Este método reduz os riscos biológicos e as barreiras operacionais para o acesso a modelos pré-clínicos em programas de descoberta e desenvolvimento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o arquivamento seguro e a recuperação rápida de modelos de camundongos geneticamente modificados para estudos baseados em hipóteses.
- Apoia a validação funcional de alvos ao garantir acesso consistente a sistemas in vivo validados.
- Facilita a triagem de portfólios ao manter um suprimento pronto de diversas origens genéticas para desvio mecanicista de riscos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece embriões padronizados com alta viabilidade para triagem fenotípica e desenvolvimento de ensaios posteriores.
- Garante reprodutibilidade e escalabilidade na geração de coortes pré-clínicas a partir de estoques criopreservados.
- Reduz a variabilidade nas entradas biológicas, apoiando fluxos de trabalho confiáveis de avaliação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Mantém modelos genéticos relevantes para doenças, permitindo comparabilidade longitudinal e entre estudos.
- Permite a continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica, protegendo linhagens críticas.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco, garantindo a disponibilidade de modelos para estudos confirmatórios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de vitrificação integra-se na interface entre geração de modelos, manejo de colônias e início de estudos pré-clínicos, permitindo uma transição contínua da engenharia genética para a validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Preserva modelos genéticos validados para testes iterativos de hipóteses e análise de vias.
- Triagem: Fornece embriões de alta qualidade para o desenvolvimento de ensaios reprodutíveis e campanhas de triagem.
- Análises: Oferece leituras quantitativas de sobrevivência e desenvolvimento para avaliar o desempenho da criopreservação.
- Pesquisa Translacional: Garante a continuidade do modelo para alinhamento de biomarcadores e estudos translacionais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada e reutilizável de criopreservação em todos os programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista ao preservar a fidelidade do modelo.
- Valor Operacional: Otimiza o gerenciamento de colônias com criopreservação e recuperação escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao garantir a disponibilidade do modelo.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço rápido de alvos validados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica no manuseio de embriões e em protocolos de criopreservação.
- Exige acesso a armazenamento em nitrogênio líquido e infraestrutura para descongelamento controlado.
- Exige padronização entre equipes para recuperação e uso posterior consistentes.
- Adaptável a uma ampla variedade de linhagens de camundongos, com otimização do protocolo conforme necessário.
- Precauções de segurança são essenciais ao manipular materiais criogênicos.
