Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

O objetivo geral do seguinte experimento é desenvolver um substrato padronizado bidimensionalmente para o controle da absorção de proteínas e do crescimento celular. Isso é alcançado utilizando litografia por luz para fabricar um molde padronizado, o qual é usado para produzir um carimbo de A-P-D-M-S para impressão por microcontato. Como segundo passo, prepara-se o substrato de ouro padronizado, o que envolve impressão por microcontato para produzir um padrão com regiões que absorvem e resistem à proteína.

A seguir, adicionam-se proteínas e células ao substrato para visualizar o padrão e realizar o estudo. São obtidos resultados de crescimento e comportamento celulares que demonstram boa confinação de proteínas e células nesses substratos padronizados, com base em microscopia de fluorescência e contraste de fase. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como a impressão MicroCon de proteínas, é que a monocamada com terminação em glicol impede a absorção não específica de proteínas e células no fundo do padrão.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a técnica adequada de carimbagem deve ser otimizada para cada padrão impresso. Para iniciar a preparação do molde padronizado, coloque a bolacha de silício no spin coater e, durante a etapa inicial do programa de centrifugação de dois ciclos, enxágue a bolacha com acetona. Durante a segunda etapa do programa de centrifugação, a acetona evaporará, deixando a bolacha limpa e seca no início da centrifugação; aplique o fotoresiste sobre a bolacha e, em seguida, realize o revestimento por centrifugação utilizando as condições descritas anteriormente.

Realize uma pré-secagem do wafer revestido com resistência fotográfica a 110 graus Celsius por dois minutos, utilizando uma placa quente de alta uniformidade. Em seguida, execute a etapa de fotopadrão. Exponha o wafer revestido com resistência fotográfica utilizando um sistema de alinhamento de máscara e uma máscara apropriada.

Primeiro, coloque o substrato sobre o suporte a vácuo do alinhador de máscaras. Em seguida, insira a máscara na bandeja do suporte e ligue o vácuo para fixar a máscara no lugar, confirmando um bom contato entre a máscara e o substrato. Eleve o substrato até que entre em contato com a máscara.

Use a óptica do alinhador para confirmar que houve bom contato. Por fim, ligue a lâmpada para expor o substrato à luz UV através da máscara litográfica. Revele a pastilha padronizada em revelador por um minuto e 45 segundos com agitação suave.

Enxágue completamente com água desionizada de grau semicondutor e seque com um jato de gás nitrogênio; verifique o desenvolvimento do padrão utilizando um microscópio com filtro UV. Inicie este procedimento preparando uma mistura de resina e endurecedor na proporção de 10 para 1 em peso. Misture completamente o Cigar 180 2.

Cubra a pastilha com padrão fotônico com a mistura em uma placa de Petri descartável em um dessecador a vácuo para desgaseificação, o molde revestido com PDMS até que não sejam mais visíveis bolhas. Após verificar que o molde está na parte inferior da placa, deixe o carimbo curar em uma estufa a 65 graus Celsius por 1,5 hora. Quando o carimbo de PDMS estiver curado, corte-o do molde e ajuste-o ao tamanho apropriado.

Armazene o carimbo em um recipiente coberto, com o lado do molde voltado para cima, para protegê-lo de poeira e detritos. Para preparar os substratos para a deposição de metal, primeiro trate lâminas de vidro redondas com plasma de oxigênio por 10 minutos. Em seguida, enxágue as lâminas duas vezes com água desionizada, secando com jato de gás nitrogênio entre os enxágues; após o enxágue com água, enxágue duas vezes com etanol, secando novamente com jato de gás nitrogênio entre os enxágues.

Usando um sistema de deposição por feixe de elétrons multipocket, deposite 50 angstroms de titânio seguidos por 150 angstroms de ouro. Não ventile o evaporador entre a deposição da camada de titânio e a camada de ouro. Enxágue o carimbo de PDMS com etanol e seque completamente.

Com gás nitrogênio, aplique a solução de carimbagem no carimbo gota a gota até que esteja completamente revestido. Seque bem o carimbo com gás nitrogênio. A microimpressão por contato do arquivo HEXA Decano depende das características do carimbo de PDMS e é um dos aspectos mais difíceis deste procedimento.

Para um carimbamento bem-sucedido, é necessário desenvolver uma técnica adequada que aplique pressão uniforme durante o processo. Para a microgravura por contato convencional no ar, pressione suavemente o carimbo sobre o substrato de ouro e deixe a monocamada formar por 15 segundos.

Alternativamente, para padrões compostos por características muito pequenas e altas razões de aspecto, coloque o substrato de ouro em uma placa de Petri contendo água desionizada de 18,2 mega ohms, garantindo que o substrato fique submerso. Em seguida, pressione suavemente o carimbo sobre o substrato de ouro e deixe a monocamada se formar por 15 segundos. A seguir, enxágue o substrato carimbado duas vezes com etanol e seque com gás nitrogênio.

Após cada lavagem, coloque o substrato em uma placa de Petri e cubra o substrato com a solução de preenchimento de fundo. Sobre o prato com parafina para evitar evaporação. Deixe a monocamada de fundo formar no escuro por 12 a 14 horas.

Por fim, remova a lamínula padronizada da solução de preenchimento traseiro e enxágue duas vezes com etanol, secando com gás nitrogênio após cada enxágue. Para aplicar a proteína na lamínula padronizada, coloque a lamínula em uma pequena placa de Petri ou em uma câmara de cultura celular. Cubra com 500 microlitros a um mililitro de solução salina tamponada com fosfato de delcos. O DPBS deve cobrir completamente o substrato durante a incubação com a proteína.

Para garantir uma cobertura uniforme de proteína, adicione uma solução concentrada da proteína ao DPBS e misture a solução pipetando várias vezes. Incube a mistura de proteína com o substrato a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, lave o substrato cuidadosamente com DPBS para remover a proteína não ligada, tomando cuidado para não secar o substrato nem expô-lo à interface ar-água.

Após três lavagens, aspire o DPBS. Em seguida, adicione aproximadamente 500 microlitros de meio de crescimento celular completo para manter um substrato úmido. Substitua o meio de crescimento utilizado para lavar o substrato.

Com meio fresco, o substrato está agora pronto para o plaqueamento com células. Normalmente, de 30 a 200 células por milímetro quadrado são plaqueadas sobre o substrato. Esta imagem mostra o carimbo A-P-D-M-S visualizado ao microscópio, colocando o lado com os recursos do carimbo voltado para baixo sobre uma lamínula de vidro; a barra de escala equivale a 100 micrômetros.

Um carimbo adequado resulta em um padrão de proteína nítido e claro, que pode ser visualizado pela aplicação de uma proteína marcada com fluoróforo, como a fibronectina marcada com LOR 6 47. A confinação das células chk one ao padrão de proteína é mostrada aqui. As barras de escala têm 100 micrômetros nestas imagens.

Alternativamente, a imunohistoquímica pode ser utilizada para visualizar o padrão proteico após fixação com SU. Aqui, o anticorpo anti-lamina conjugado com LOR três 50 é usado para visualizar a lamina padronizada semeada com neurônios do hipocampo de camundongo E 18, mostrados após quatro dias in vitro. Neurônios do hipocampo de camundongo E 18 corados com o marcador MIT vermelho cinco 80 mostram que o crescimento celular está bem confinado ao padrão proteico. Embora esta técnica seja facilmente dominada, diversos problemas comuns podem surgir, conforme ilustrado por essas preparações de substratos padronizados visualizadas por absorção de fibronectina conjugada com LOR 6 47.

A aplicação da proteína sem uma mistura adequada da solução concentrada de proteína no DPBS pode levar a padrões proteicos irregulares. Uma carimbagem inadequada pode resultar em transferência parcial do padrão ou colapso do carimbo. Além disso, expor o substrato com o padrão contendo proteína absorvida ao ar pode perturbar a monocamada, causando diminuição da resistência.

No plano de fundo, o padrão submerso pode produzir estruturas com características pequenas que são difíceis de imprimir por meio de microimpressão por contato convencional e ar. Essas duas imagens mostram regiões diferentes do mesmo padrão impresso com o mesmo carimbo de PDMS no ar ou na água desionizada; linhas de suporte são mostradas na imagem à esquerda para demonstrar que apenas as características menores do padrão não foram impressas com sucesso. As barras de escala correspondem a 20 micrômetros. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 18 a 24 horas, se for executada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar um substrato com padrão. Produzir carimbo A-P-D-M-S. Utilizar a impressão por microcontato para preparar um substrato de ouro com padrão e visualizar esse padrão utilizando proteínas e células.