Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

O objetivo geral deste procedimento é criar poros transitórios nas membranas celulares utilizando impressão jato de tinta. Isso é realizado primeiramente modificando uma impressora jato de tinta padrão. O segundo passo é esvaziar e limpar um cartucho de tinta de impressora convencional para permitir a inserção da tinta biológica.

Em seguida, as células de interesse são suspensas em uma solução de monômeros de actina marcados com fluoróforo e PBS para criar a solução de bio-tinta. O passo final consiste em imprimir a bio-tinta sobre lâminas de microscopia utilizando a impressora e a cartela modificadas. Em última análise, a microscopia de fluorescência pode ser utilizada para demonstrar que os monômeros de actina G conjugados com o Fluor quatro foram internalizados pelas células impressas através de poros transitórios na membrana.

A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas padrão de transfeção e microinjeção celular é que esta técnica de impressão é fácil de usar e proporciona alta viabilidade celular. Embora esta técnica possa fornecer insights na genética, ela também pode ser aplicada a outras áreas de estudo, como biofísica celular e engenharia de tecidos na biofísica celular. Esta técnica pode ser utilizada para observar facilmente o citoesqueleto de uma célula durante a migração celular.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejamos visualizar alterações no arranjo do citoesqueleto devido a forças aplicadas sobre as células. Comece destravando os clipes plásticos da base inferior da impressora e, em seguida, levante lentamente a tampa plástica superior. Em seguida, desconecte o painel de luz do visor de botões do topo da impressora, mantendo-o conectado à placa-mãe da impressora.

Usando lenços de papel Kim e etanol, limpe o interior da impressora, especialmente as áreas onde o cartucho de tinta repousa e onde ocorre a impressão. Em seguida, localize o cabo que fornece energia aos mecanismos de alimentação de papel da HP Desk Jet 500.

Eles estão logo abaixo da bandeja de papel, à esquerda da parte frontal; desconecte os cabos da placa-mãe. Agora localize o mecanismo de detecção de papel e fixe um laço de arame na alavanca de plástico cinza localizada acima e atrás do mecanismo de alimentação de papel, para servir como uma alça manual; coloque uma plataforma aqui. O suporte de espuma de transporte para 15 tubos de centrífuga é usado com várias lâminas de microscópio fixadas com fita na região de impressão, à frente do mecanismo de alimentação de papel, para posicionar as lâminas desejadas em um nível logo abaixo da cabeça de impressão do cartucho.

Por fim, para manter a técnica asséptica, coloque a impressora dentro de uma cabine de fluxo laminar. Comece removendo o cartucho da embalagem, mantendo a fita protetora que cobre os contatos da impressora e a cabeça de impressão. Estabilize o corpo do cartucho com um grampo, deixando a parte superior verde livre de qualquer obstáculo, utilizando uma ferramenta de corte rotativa portátil.

Corte a parte superior verde do cartucho, esvazie toda a tinta remanescente do reservatório e, em seguida, remova a fita plástica protetora que cobre os contatos do impressor e a cabeça de impressão. É provável que a água vaze da cabeça de impressão durante esse processo, mas isso não causará nenhum dano ao cartucho. Quando a água escorrer limpa, deixe o cartucho secar.

Para manter um ambiente de impressão limpo, comece mergulhando completamente o cartucho em um béquer cheio de água desionizada e, em seguida, submeta o cartucho à sonicacao por 15 minutos. Após a sonicacao, remova o cartucho e agite para eliminar o excesso de água. Pulverize etanol a 70% dentro do cartucho para criar um ambiente mais asséptico.

Após colher as células de interesse, centrifugue as células em cinco mililitros de meio fresco em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros por cinco minutos a 250 vezes G, em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o meio e então re-suspenda as células a uma concentração de um vezes 10 à quinta células por mililitro em solução estoque fluorescente de actina G recém-preparada. Para criar a bio-tinta, observe que 250 microlitros de bio-tinta imprimem três lamínulas com o padrão de linhas mostrado aqui. Após ligar a impressora e aguardar seu aquecimento, coloque a superfície de impressão desejada aqui; lamínulas de 22 milímetros por 22 milímetros são utilizadas no centro do estágio previamente montado.

Em seguida, abra um programa de desenho e selecione o padrão desejado. Agora, pipete de 100 a 120 microlitros da suspensão celular no pequeno poço circular na parte inferior do compartimento da cartucho. Imprima o arquivo enquanto a impressora aquece novamente; nesse momento, o cartucho se moverá para a posição de espera.

Quando o cartucho se mover ligeiramente para a esquerda do poço de gotejamento de tinta e permanecer nessa posição, puxe para cima o mecanismo de alimentação de papel; o fio e a impressão serão iniciados. A impressora imprimirá sobre a lamínula colocada no centro da plataforma de impressão utilizando uma impressora jato de tinta HP 500 com uma bio-tinta composta por uma suspensão de células fibroblásticas em uma solução de monômero de G-actina.

Em uma série de cartuchos de tinta HP 26, células de fibroblastos foram impressas em lamínulas de vidro para microscopia. Esta figura ilustra um resultado representativo de células de fibroblastos impressas que mostram monômeros de actina fluorescente incorporados. Este padrão foi utilizado na figura anterior para criar uma linha contínua da solução de impressão ao longo da maior parte da lâmina de microscopia.

Nesta figura, mostra-se a linha reta na qual o biolink e as células foram mutualmente depositados. Observe que imediatamente após a impressão, há um aumento da fluorescência de fundo porque a solução de biolink na qual as células estão suspensas contém monômeros fluorescentes de actina em excesso; a incubação das células por cerca de 10 minutos após a impressão facilita a adesão à lâmina, permitindo que a solução em excesso do monômero seja removida do substrato com meio de crescimento fresco, reduzindo significativamente a fluorescência de fundo. Aqui, uma imagem representativa de três fibroblastos T3 impressos em uma zona de impressão localizada, conforme mostrado; esta microfotografia de microscopia fluorescente de uma célula obtida 15 minutos após a impressão mostra a actina em verde, o núcleo em azul e a sobreposição da actina GI e do corante nuclear.

As próximas duas imagens mostram a microscopia de fluorescência de dois fibroblastos em um padrão linear três horas após a impressão. Esta primeira imagem mostra monômeros de actina marcados com fluorescência no interior das células. Esta segunda imagem é uma sobreposição do canal de fluorescência com a imagem de fundo, demonstrando que, embora possa haver algum detrito na lâmina no canto inferior esquerdo, ele não fluoresce.

Por fim, é apresentado aqui um grupo controle de células não impressas incubadas por três horas com monômeros marcados fluorescentemente, para demonstrar que os monômeros não conseguem penetrar na membrana celular sem a permeabilização da membrana proporcionada pela impressão celular. Ao tentar realizar este procedimento, é importante ter várias cartuchos limpos e prontos para uso, já que o entupimento da impressora é um dos problemas que retarda esta técnica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como converter uma impressora desktop comum para imprimir células vivas, o que ajuda a criar uma força transitória na membrana.