Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar o mapeamento de destino e o rastreamento da linhagem de células individuais selecionadas em embriões de peixe-zebra. Isso é conseguido por meio da conjugação química de fluoresceína encapsulada a dextrana de alto peso molecular. Em seguida, a dextrana com fluoresceína encapsulada preparada é microinjetada em embriões de peixe-zebra, sendo posteriormente ativada por luz em células selecionadas mediante absorção de dois fótons.

Após a ativação fotoquímica dos embriões, realiza-se uma análise imunohistoquímica para detectar o dextrano fluoresceína desencapsulado, com o objetivo de mapear o destino das células ativadas. Em última instância, este método pode ser utilizado para determinar a contribuição da linhagem e a localização tecidual de células únicas ativadas pela luz. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia de fluorescência padrão, é que ela pode ser usada para rotular diferencialmente células individuais para o mapeamento fiel do destino celular.

Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como a forma pela qual células precursoras indiferenciadas podem contribuir para diferentes tipos de tecidos. A demonstração visual é essencial, pois os passos de montagem do embrião e de ativação fotônica são difíceis de aprender apenas com base em descrições textuais. Antes de começar, sintetize o dextrano de fluoresceína "cageado" e armazene-o em tubos revestidos com folha de metal. Em seguida, injete microscópicamente os embriões no estágio de uma a duas células com o dextrano de fluoresceína "cageado" sintetizado.

Após os embriões terem atingido o estágio apropriado de desenvolvimento, revestia-os. Em seguida, monte os embriões revestidos em agarose de baixo ponto de fusão para ativação fotônica. Quando o agarose tiver solidificado, carregue o software LSM cinco 10.

Coloque um filtro amarelo transparente no trajeto do feixe de luz branca e, em seguida, selecione escanear nova imagem e clique em iniciar modo experto. Selecione a aba do laser, ligue as fontes de laser de argônio e de mi tai. Ajuste o comprimento de onda do mi tai para sete 40 nanômetros.

Em seguida, selecione a aba config. Defina as configurações do caminho óptico para o íon argônio e o laser mi tai. Depois, selecione a aba scan.

Altere a objetiva para 20 vezes 0,8. Defina a velocidade máxima de varredura clicando em modo máximo, definindo método e número como média de linha e um, respectivamente, na guia canais, desmarcando todas as fontes a laser exceto o mi tai. Em seguida, coloque um medidor de potência no trajeto do feixe óptico e selecione o botão con para ativar a varredura contínua.

Ajuste a porcentagem de transmissão até que o medidor de potência indique uma potência média do laser de 47 miliwatts. Em seguida, interrompa a varredura selecionando o botão de parada na guia canais. Desmarque a fonte de laser mi tai e selecione o ferro argonne.

Em seguida, selecione novamente o botão XY rápido na guia canais e ajuste o diafragma. Detecte o ganho, amplifique um deslocamento e amplifique novamente com o laser de ferro de Argonne para obter a melhor qualidade de imagem. Usando o controlador de estágio, localize e foque na célula a ser ativada, então clique no botão de parada. Usando a ferramenta de recorte, recorte a célula ativada de modo que o fator de recorte na guia modo exiba de 50 a 70.

Em seguida, pare a varredura selecionando o botão de parada na guia canais. Desmarque o laser de íons argônio e selecione o laser My Tai na guia modo. Defina a velocidade de varredura para 31,46 segundos.

Em seguida, selecione o botão único para iniciar a varredura com ativação por dois fótons da dextrana de fluoresceína coqueluchada na célula selecionada. Após a ativação, vá até a guia canais e desmarque agora o laser mi tai e marque novamente o laser de íons argônio. Em seguida, em modo, defina o fator de zoom para um. Próximo.

Na seção de velocidade, clique no botão máx. para definir a velocidade máxima de varredura. Para revisar a região ativada pela luz, selecione xy rápido. Em seguida, selecione a guia canais e ajuste o pinhole e detecte novamente; verifique se a região ativada pela luz não foi ablacionada pelo laser.

Após preparar os embriões fotoativados para a imunodetecção de dextrano fluoresceína desencapsulado seguindo o protocolo descrito no manuscrito anexo, lave os embriões seis vezes em PBT e duas vezes em tampão AP. Em seguida, transfira os embriões para placas de nove poços contendo tampão AP.

Em seguida, aspire o tampão AP e adicione N-B-T-B-C-I-P. Interrompa o desenvolvimento da coloração com N-B-T-B-C-I-P aspirando a solução de N-B-T-B-C-I-P. Então, lave os embriões em PBT.

Agora recupere os embriões e agite-os em uma plataforma rotativa durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, repita a lavagem com PBT mais duas vezes. Por fim, monte os embriões em agarose de baixo ponto de fusão a 0,6% e adquira imagens das células fotoativadas utilizando um microscópio composto ereto.

Nesta figura, uma imagem de campo claro mostrada à esquerda e uma imagem fluorescente mostrada à direita de um embrião de peixe-zebra microinjetado com uma fita de dextrana de fluoresceína contida, antes da fotoativação. Conforme mostrado aqui, o embrião foi fotoativado em um dos somitos indicado pela seta na figura de campo claro à esquerda, com um comprimento de onda de 407 nanômetros, um tempo de varredura de 31 segundos e uma potência média do laser de 47 miliwatts. Na figura à direita, após a fotoativação, pode-se observar a fluorescência proveniente da dextrana de fluoresceína liberada nesta figura.

A coloração imunológica do dextrano fluoresceína desprotegido é mostrada em uma pequena região da placa lateral, mesoderma de um embrião na fase de 10 horas. O local foi ativado por luz usando os mesmos parâmetros a laser da figura anterior, mediante o procedimento de imunodetecção. A região ativada, indicada aqui pela seta, pode ser identificada com coloração de fundo mínima após este procedimento.

Uma análise adicional, como imunomarcação para diferentes marcadores específicos de tecidos, pode ser realizada para caracterizar melhor a localização e o destino das células marcadas. Com esta técnica, abre-se caminho para que pesquisadores na área de biologia vascular estudem a origem de células progenitoras arteriais e venosas em embriões de peixe-zebra em desenvolvimento. Não se esqueça de que, ao manipular reagentes químicos como NBT e BCIP, eles podem ser extremamente perigosos e é sempre necessário usar luvas.