Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

O método mostrado neste vídeo utiliza mapas de destino do embrião em estágio de clivagem de opus para identificar isoladamente a cultura de um único blaster, a fim de avaliar se o sulfato embrionário é determinado por instruções intrínsecas ou extrínsecas. Primeiro, embriões de duas células são coletados, nos quais o sulco da primeira clivagem divide ao meio a área levemente pigmentada do hemisfério animal. Esses embriões são cultivados até atingirem de 16 a 32 células, momento em que a membrana vitelínica é removida e as células vizinhas são dissecadas e afastadas da célula escolhida. Por exemplo, o blaster dissecado é então transferido para uma depressão em um poço de cultura revestido com auger e mantido em cultura.

Uma vez que o explante atinja o estágio desejado, ele é coletado para avaliar a expressão gênica ou proteica por meio de hibridização in situ, QPCR ou imunohistoquímica. A principal vantagem desta técnica em relação a outras, como o cultivo de grandes grupos de células embrionárias ou órgãos em meio de cultura, é que blastômeros embrionários individuais, cujo destino de desenvolvimento é conhecido a partir de estudos de linhagem celular, podem ser cultivados sem a adição de fatores de crescimento ou na ausência de células vizinhas. Assim, pode-se testar diretamente se fatores intrínsecos à célula instruem esse blastômero a tornar-se precursor de um tecido específico ou se são necessários sinais provenientes de células adjacentes.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a dissecação dos Blairs e sua transferência para poços de cultura exigem manipulações delicadas sob o microscópio estereoscópico. Neste vídeo, utilizarei este método para demonstrar se os RNAs mensageiros derivados da matriz direcionam as células para um destino neural. Trabalhando sob um microscópio de dissecação, afie quatro pares de pinças utilizando filme abrasivo Illumina.

Um par de pinças serve como reserva caso a ponta seja danificada durante o procedimento; autoclave as quatro pinças e armazene em um recipiente estéril. Prepare 500 mililitros de solução de salina de Barth modificada (MBS) em concentrações 0,1 x e 1,0 x e filtre para esterilização. Armazene essas soluções de 14 a 18 graus Celsius por meses em um frasco de vidro com tampa de rosca. Prepare 2% de aros grau eletroforese em 100 mililitros de meio de cultura 1 x. Autoclave para dissolver o aros e use o micro-ondas para liquefazer o aros quando for necessário novamente, enquanto o aros estiver líquido.

Despeje cerca de 0,5 mililitros no fundo de cada poço de uma placa de cultura estéril de 24 poços. Isso impedirá que os implantes aderem ao plástico. Em seguida, despeje cerca de dois a três mililitros no fundo de dois a três placas de Petri de 60 milímetros e gire suavemente para distribuir.

Esses irão servir como placas de dissecação e o aros impede que os embriões aderem ao plástico. Após a remoção de suas membranas, quando o aros tiver esfriado e endurecido, aqueça a chama até que a ponta de uma pipeta Pasteur de seis polegadas derreta e forme uma esfera. Reaqueça brevemente a esfera, em seguida toque-a levemente na superfície do aros em um poço da placa de cultura.

Isso criará uma depressão rasa na qual o X explan será colocado. Repita para cada poço da placa. Em seguida, preencha cada poço da placa de cultura com um mililitro de um meio de cultura estéril x.

Em seguida, preencha o recipiente de dissecação com MBS 0,1 X para facilitar a separação dos blastômeros. Uma vez que os recipientes de dissecação estejam preparados, transfira os ovos fertilizados com as camadas de gelatina removidas para placas de Petri de 100 milímetros contendo meio de cultura 0,5 x. Os ovos que não forem utilizados imediatamente podem ser cultivados a 14 graus Celsius enquanto o primeiro recipiente é examinado em busca de embriões de duas células.

Examine os embriões no primeiro recipiente de Petri usando um microscópio de dissecação; com uma pipeta plástica de transferência, transfira cerca de 10 embriões de uma célula e de duas células para um recipiente separado contendo meio de cultura a 0,5 x. Coloque o recipiente de Petri em uma incubadora a 14 graus Celsius. A capacidade deste ensaio em avaliar com precisão o potencial de desenvolvimento de uma célula depende da dissecação da blasmeria correta com base nos mapas de destino celular.

Portanto, é fundamental escolher embriões com o padrão correto de pigmentação no estágio de duas células, que consequentemente apresentem padrões normais de clivagem. Como ilustrado aqui. Clivagens normais frequentemente ocorrem apenas em um lado do embrião.

Esses embriões ainda podem ser usados como doadores se a célula doadora for proveniente do lado normal. Quando os embriões atingirem o estágio de duas células, separe aqueles em que o primeiro sulco de clivagem divide ao meio a área levemente pigmentada no hemisfério animal para um recipiente separado, separando cerca de cinco vezes mais embriões do que serão dissecados. Esses serão os doadores para o explante.

Mantenha os dois embriões restantes de duas células em uma placa separada ao lado dos embriões doadores durante todo o procedimento, para servirem como controles irmãos no estadiamento do explante. Após os embriões serem classificados e dissecados, retorne às placas no incubador para encontrar mais embriões de uma célula e de duas células. Como os embriões de uma célula levam cerca de 90 minutos para se dividir, isso pode ser feito até duas horas após a coleta dos ovos.

Para preparar o explante, coloque cinco a 10 embriões em uma placa de dissecação. Em seguida, posicione o primeiro embrião de modo que a membrana vitelínica transparente possa ser segurada com uma pinça. Normalmente, ela não pode ser vista, mas pode ser agarrada no polo animal, onde está separada por um espaço perivitelino claro acima da superfície do embrião.

Usando uma pinça afiada em uma das mãos, segure a uma distância do blastocisto que será dissecado para evitar danificá-lo. Em seguida, com a outra pinça afiada na outra mão, segure a membrana próxima à ponta da primeira pinça e puxe suavemente em direções opostas para destacar a membrana. O embrião se achatará quando a membrana tiver sido removida.

Em seguida, agarre uma célula vizinha com a pinça e use essa célula como alça, de modo que a célula a ser dissecada não entre em contato direto com a pinça na outra mão, puxando suavemente as demais células vizinhas para longe da blasópore desejada. Se as células da linha média, que compartilham o mesmo destino, forem as alvos, elas podem ser removidas juntas, em pares. Por fim, dissecar a célula alça.

Pegue o blastocisto ou par amêrio com uma pipeta de vidro Pasteur estéril, evitando bolhas de ar e sucção excessiva. Coloque a ponta da pipeta Pasteur abaixo da superfície do meio de cultura em um poço da placa de cultura de explante X, e expulse suavemente o blastocisto. Este deve deslizar para dentro da depressão rasa pela ação da gravidade.

Blástulas de mais de um embrião podem ser combinadas em uma única expalna depositando-as na mesma depressão de uma placa de cultura. Repetiremos este procedimento com os embriões restantes na placa de dissecação, um a um. Após cerca de 10 embriões, a placa de dissecação estará cheia de detritos celulares.

Quando isso ocorrer, mude para o próximo recipiente de dissecação. Após todas as dissecações serem concluídas, verifique se os explantes estão nas depressões rasas. Caso contrário, eles podem ser suavemente empurrados para dentro da depressão com um laço de cabelo que tenha sido esterilizado em etanol 70% e secado ao ar. Incube os implantes em temperatura ambiente sobre a bancada cerca de uma hora após a última dissecação.

Remova os detritos ao redor do explante cicatrizado com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril. Incube a placa do explante a 14 a 20 graus Celsius ao lado da placa de Petri contendo os embriões controle irmãos. Os embriões irmãos indicarão o estágio de desenvolvimento do explante blasfemo.

Após cerca de uma a duas horas em cultura, os blastômeros explantados terão se dividido aproximadamente quatro vezes e eliminado a maior parte dos detritos provenientes das células vizinhas danificadas. Após 20 horas, formam pequenas esferas resistentes de células. Quando os irmãos atingirem o estágio de desenvolvimento desejado, colete o explante.

Esses explantes sobrevivem bastante bem, mesmo que algumas das células se desintegrem. Portanto, se houver uma massa turva na cultura, vamos explorá-la com um laço de cabelo ou pinça para determinar se um explante saudável está enterrado no interior. Recolha o explante em um pequeno volume de solução de cultura com uma pipeta de vidro e expulse suavemente na solução fixadora ou no tampão de lise apropriado para o ensaio a ser realizado.

Dois blasfemadores dorsais ou dois blasfemadores ventrais foram dissecados no estágio de 16 células e cultivados em um XMBS a 14 graus Celsius até que embriões irmãos atingissem estágios iniciais de placa neural. Cada amostra foi analisada quanto à expressão de uma placa neural zigótica. O gene Sox dois por hibridização in situ, que é visto como o produto da reação azul.

Os resultados deste ensaio demonstram que a maioria dos blastômeros animais dorsais, que são precursores da placa neural, pode expressar SOX2 autonomamente, ou seja, sem sinalização adicional de outras regiões do embrião. Aqueles espécimes que não expressam SOX2 podem ter sido incorretamente identificados no momento da dissecação.

Em contraste, nenhum dos blasfemadores animais ventrais, que são precursores da epiderme ventral, expressa SOX dois. Esses dados indicam que os blasfemadores animais dorsais possuem uma capacidade intrínseca de formar tecido neural, ao passo que os blasfemadores animais ventrais não possuem. Alguns dos explantes dorsais também apresentaram uma morfologia alongada, indicativa da formação de mesoderma dorsal.

Esses blastômeros também são atenuados para formar o Noor no embrião intacto e uma cultura de explante expressa uma proteína marcadora do Noor para testar o efeito da alteração dos níveis endógenos de um gene neural materno expresso. Os RNAm do Fox D cinco foram injetados nos blastômeros precursoras ventrais de oito células. Como mostrado aqui, a maioria dos implantes ventrais expressou SOX dois.

Por outro lado, quando o nível endógeno de Fox D cinco foi reduzido pela injeção de oligonucleotídeos antissenso tipo morph em precursores dorsais de oito células, apenas alguns explantes dorsais expressaram SOX dois. Esses experimentos indicam que a expressão materna de Fox D cinco desempenha um papel na capacidade intrínseca dos blastômeros dorsais de adquirir um destino neural antes desse procedimento. Outros métodos, como a injeção nos blastômeros a serem dissecados, de RNAs mensageiros para ganho de função ou oligonucleotídeos antissenso tipo morph para perda de função, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.

Por exemplo, quais genes estão envolvidos na capacidade intrínseca das células de gerar um destino de desenvolvimento específico? Além disso, pode-se testar fatores de sinalização conhecidos adicionando fatores purificados ao meio de cultura. Essa abordagem também pode ser usada para transplantar blastômeros individuais para locais novos no embrião intacto.

Este teste verifica se a célula transplantada está comprometida com seu destino de desenvolvimento original; essa informação é fundamental para definir os mecanismos celulares pelos quais uma célula embrionária pluripotente se compromete em tornar-se a precursora de um tecido definido.